破骨細胞特異的Gタンパク質共役受容体GPR137Bの機能解析と制御化合物探索

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08145
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 石橋 宰 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70293214)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 池亀 美華 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (70282986) ; 乾 隆 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (80352912)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 破骨細胞 / 骨代謝 / GPCR / ゲノム編集 / マクロファージ

Outline of Annual Research Achievements

破骨細胞の分化や生理機能に重要な役割を担う遺伝子を探索するために、マウス単球・マクロファージ系細胞株Raw264から分化させた成熟破骨細胞を純粋に単離する系を確立し、次世代シーケンシングによる網羅的トランスクリプトーム解析（RNA-seq）を実施した。その結果破骨細胞選択的に高発現する遺伝子の1つとして同定されたGPR137BはGタンパク質共役受容体（GPCR）をコードするが、そのリガンドは同定されておらず、機能に関する報告も存在しない。一方、破骨細胞様細胞を多く含むヒト巨細胞腫組織においてもGPR137B遺伝子の高発現が示されたことから、ヒトの破骨細胞においてもGPR137Bが何らかの生理的機能を担うことが推測される。
そこで、マウスGPR137Bに対するポリクローナルペプチド抗体を作製し、同抗体を用いてRaw264細胞から分化させた破骨細胞を免疫染色したところ、GPR137Bの細胞膜への局在が示された。次に、破骨細胞の細胞膜にCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術によりRaw264細胞のGPR137B遺伝子破壊を試み、その結果3種類の独立したGPR137B欠損細胞株が得られた。これらの細胞株、および同様の処理を施した正常細胞株について、RANKL存在下で培養することにより破骨細胞分化を誘導した。その結果、GPR137B欠損細胞株において破骨細胞マーカー遺伝子発現の顕著な低下が認められた。一方、これらの細胞をLiposaccharideにて処理し活性化マクロファージへと誘導した場合には、マクロファージ活性化の指標となる遺伝子群（IL-1a等）の発現に差は認められなかった。以上の結果から、GPR137Bは破骨細胞・マクロファージ前駆細胞から破骨細胞への分化に選択的に関与することが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の研究計画通り、Raw264細胞から分化させた破骨細胞におけるGPR137Bの局在を解析し、かつ同細胞のGPR137B遺伝子欠損株の作出に成功し、in vitroにおいてGPR137Bが破骨細胞分化に関わることを示すことができた。

Strategy for Future Research Activity

計画通り、GPR137B遺伝子欠損Raw264細胞株にGPR137B遺伝子を外来性に強制発現させ、減弱した破骨細胞分化能が回復することを確認する（レスキュー実験）。その後、GPR137B遺伝子欠損株および正常細胞株からそれぞれRNAを抽出し、遺伝子アレイを用いて遺伝子発現の差異を網羅的に調べ、ネットワーク解析を行うことにより、GPR137Bを介した破骨細胞分化の作用機序について解析を行う。
なお、上述の抗GPR137B抗体では、ウェスタン解析によるGPR137Bタンパク質の検出には成功していない。そこで、上述細胞株におけるGPR137B遺伝子の欠損をタンパク質レベルで確認するため、別の領域をエピトープとした新たなペプチド抗体を作製し、ウェスタンブロッティングで解析する。

Causes of Carryover

当該年度の実験に必要な多くの試薬について、キャンペーンやディスカウントセール等により予定より安価に購入できたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

現在使用している抗体が実験の種類によっては機能しないことが判明し、新たな抗体を作製する必要が生じたため、その費用に充当する予定である。