2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K08148
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
竹之内 敬人 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門 動物機能利用研究領域, 主席研究員 (20292518)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
月本 光俊 東京理科大学, 薬学部薬学科, 講師 (70434040)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 自然免疫応答 / 神経調節因子 / マクロファージ / 非典型的分泌機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、神経調節因子として知られる中脳アストロサイト由来神経栄養因子(MANF)とジアゼパム結合阻害因子(DBI)について、マクロファージ系細胞における産生・分泌制御機構及び生理作用を解析し、脳や末梢組織の自然免疫系における役割を明らかにする。
本年度は、マウス組織マクロファージの不死化細胞株である脳ミクログリア由来MG6細胞、腎臓糸球体マクロファージ由来KM1細胞からのMANFとDBIの分泌機構について解析した。またブレビバチルス菌を用いた組換えタンパク質作製法（BIC法）について検討した。
MANFに関しては、細胞溶解液をウエスタンブロット法で解析したところ複数のバンドが検出されたことから、タンパク質修飾を受けたと考えられる複数のMANF分子種が存在する可能性が示唆された。それぞれのMANF分子種の存在割合は、MG6細胞とKM1細胞の間でも異なることがわかった。また、ATP刺激による両不死化マクロファージ細胞株からのMANFの細胞外への分泌には、P2X7受容体活性化を介した分泌機構が関与することが示唆された。特に、リポ多糖で前処理した場合には、MANF分泌量も多くなることが確認された。さらに、BIC法を用いて組換えマウスMANFタンパク質を菌体外に直接分泌・生産するシステムを作製した。
一方、DBIに関しても、ATP刺激で濃度依存的な不死化マクロファージ細胞株からの細胞外への分泌を確認した。ところが、DBIの発現量は比較的少ないため、特にウエスタンブロット法で検出するためには、サンプル中のタンパク質を濃縮するなどの前処理が必要であることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、ATP刺激によるマウス不死化マクロファージ細胞株からのMANFとDBIの細胞外への分泌機構について解析を進めた。MANFについては、修飾を受けたと考えられる複数のタンパク質分子種が存在すること、BIC法を用いた組換えタンパク質の分泌生産系が利用可能であることなど、いくつかの新しい知見を得ることができた。また、DBIの分泌に関してもウエスタンブロット法による検出系の検討を進めた。よって、当初の研究計画に従っておおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、MANFに関しては不死化マクロファージ細胞株に加えて初代培養マクロファージも用いて、分泌制御機構について再現性を確認していく。本年度、複数のMANF分子種が存在する可能性が示唆されたことから、糖鎖付加などタンパク質修飾についての検討も進める必要があると考えている。また、分泌性の膜小胞であるエキソソームとの関連についても検討する。BIC法で分泌生産した組換えMANFタンパク質の精製法を検討し、その生理活性を確認する。DBIについてもMANFと同様な解析を順次進める予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度は、研究代表者が所属していた研究機関が他の研究機関に統合され、事務手続き等システム上の問題を含め様々な混乱が予想されたため、実験実施への影響を考慮した研究計画を立てていたが、予想より影響が大きく、次年度使用額が生じてしまった。研究の進行はおおむね順調であるが、得られた結果の再現性を確認する実験回数が不足していることが主な原因であると考えている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
約15万円の次年度使用額が生じたが、MANFに対する抗体（市販品、1件あたり5-10万円）や、ウエスタンブロット法の検出試薬の購入等に使用する予定である。本年度得られた結果からも、MANFには複数の分子種が存在する可能性が高まったので、認識部位の異なる市販のMANF抗体を購入する。
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