2016 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
16K08153
|
|---|
| Research Institution | Tohoku University |
|---|
Principal Investigator |
鬼塚 和光 東北大学, 多元物質科学研究所, 助教 (00707961)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | ロタキサン / 環状核酸 / DNA / RNA / 翻訳 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ロタキサンやカテナンといった環状分子を中心とするインターロック型の分子構造体は、そのユニークな構造や性質のため、様々な研究が試みられている。本研究では独自に開発した化学修飾環状核酸を利用して以下の二つの機能創出を目指している。
①核酸配列内部で環状構造（擬ロタキサン）を形成する技術を利用した翻訳制御機能
②滑り込みによる擬ロタキサン形成法を利用したmiRNA捕捉機能
①に関して、本年度は擬ロタキサン形成オリゴDNA(prfODN)を用いて翻訳阻害効果を調査した。まず、モデル実験としてホタルルシフェラーゼの配列の一部を持つ60merのRNAに対して擬ロタキサン形成を行ったところ、従来の配列と同等の効率で形成反応は進行した。次に、ホタルルシフェラーゼの配列を持つmRNAに対し合成したprfODNを用いて擬ロタキサン構造を形成させた。そのmRNAおよび細胞抽出液を用いて、試験管内で翻訳反応を行い、ルシフェラーゼ発光を調査した結果、試したprfODNに翻訳阻害効果は観測されなかった。現在は、mRNAに対して擬ロタキサン構造を形成可能かに関して検討を行っている。
②に関して、これまで面白い現象として、環状化したDNAが標的RNA鎖に滑り込み擬ロタキサン構造を形成できることを発見していたが、その詳細なメカニズムは不明であった。今回我々は、様々な標的配列に対する擬ロタキサン形成速度定数を算出することで、このスリッピングには環状構造の外部にあるテイル部分の配列が非常に重要であることを明らかにした。この成果は、Nucleic Acids Res.誌に報告した。この知見を基に、miRNA関連技術へ展開していく予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記①核酸配列内部で環状構造（擬ロタキサン）を形成する技術を利用した翻訳制御機能に関して、翻訳阻害効果は観測されなかったが、RNAに対する擬ロタキサン形成はモデルの実験ではうまくいっており、一年目としては順調に進んでいるといえる。また、様々な検討の結果、今後の展開につながるいくつかの知見は得られており、ネガティブなデータと併せて、来年度につなげていく予定である。
②滑り込みによる擬ロタキサン形成法を利用したmiRNA捕捉機能に関して、基礎の部分の詳細なデータを集めることで、メカニズムに関する研究をまとめることができた。この基礎的検討は今後の展開にも非常に重要であり、おおむね順調に進展しているといえる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
①に関して、翻訳阻害効果が観測されなかった原因がmRNAに対して擬ロタキサン構造を形成できていないためなのか、または形成できているがリボソームのヘリケース活性のため翻訳が阻害されないのかに関しては現在のところはっきりできていない。一つのアプローチとして、擬ロタキサン構造を形成したときのみ蛍光を発する人工核酸の創製を行うことを考えている。このプローブを完成することができれば、翻訳阻害に関する知見を得られるだけでなく、RNAのラベル化へも展開が可能である。
②に関して、基礎的部分は順調に進んでいるので、miRNAに関する技術応用のため、まず比較的環サイズの大きい環状核酸を用いて阻害効果を検討していく予定である。
|
| Causes of Carryover |
機能性核酸合成の試薬に関して、条件を検討することで最小量の試薬で様々な誘導体を合成することに成功したため、計画より大幅なコスト削減に成功した。加えて昨年ヨーロッパで開催された学会で情報収集を行う計画であったが、連続するテロ事件を心配し参加を控えたため、その分の予算が残ることになった。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
一年目の研究から生まれた課題、mRNAに対して擬ロタキサン構造を形成可能か、を解決するために新たな合成や機能評価を必要とするため、一年目で削減できた予算を利用して最終目的達成のため実験を追加する予定である。また、２年目には様々な生物系の実験を予定しており、これまで研究室で行っていないアッセイ系の立ち上げ等も行うため、削減できた予算も加えて、最適なアッセイ系を速やかに確立し、最終目標に向けて実験を進めていく予定である。
|
