2016 Fiscal Year Research-status Report

膜貫通ヘリックス固定型tethered膜の作製と膜内タンパク質補足計測

Research Project

Project/Area Number	16K08194
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	矢野義明京都大学, 薬学研究科, 講師 (60402799)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	膜貫通へリックス間相互作用 / 膜貫通ヘリックス固定型tethered膜
Outline of Annual Research Achievements	ポリエチレングリコール(PEG)でカバーガラス表面をコーティングし、かつ一部のPEGの先端に膜貫通ヘリックスを付加したガラス基板の作製を行った。蛍光色素carboxyrhodamine110またはtetramethylrhodamineを標識したモデル膜貫通ヘリックス（色素―AALALAAAGLALGAAALALAA）を平均分子量5000のPEGを介してカバーガラス表面にコーティングした。まず、PEGをガラス表面に付加し、次に有機溶媒TFE中で膜貫通ヘリックスに付加したazideとPEGに付加したDBCOを click chemistryによって反応させる手順でヘリックスをPEGコーティングの表面に均一に付加できることが明らかになった。ヘリックス色素の蛍光強度を共焦点顕微鏡で定量し、巨大一枚膜ベシクルに組み込んだ蛍光標識脂質の蛍光強度との比較から、脂質／ヘリックス比（～700）を見積もった。またFCS法により、ガラス表面に載せた巨大一枚膜ベシクル中に組み込んだ蛍光標識ヘリックスおよび蛍光標識脂質の側方拡散を測定することができた。しかしながら、PEG表面にコーティングした膜貫通ヘリックスが巨大一枚膜ベシクルに挿入する速度が非常に遅く、一晩インキュベート後でも殆ど膜挿入が見られないことが明らかになった。膜貫通ヘリックスがPEG上で凝集、あるいはガラス表面に吸着したために、上部に膜が存在しても膜挿入速度が遅くなっている可能性が考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 初年度は膜貫通ヘリックスアンカー型繋ぎ止め膜作製・FCS測定による側方拡散測定の抑制を目標に研究を行った。tethered膜の形成に必要なコーティング技術および測定法を確立する事ができた。特に膜貫通ヘリックスを均一にコーティングする方法を確立できたことから目標の大部分は達成できた。
Strategy for Future Research Activity	今後、従来法を参考に超音波、ベシクル内外の浸透圧負荷、加熱などの処理によって、基板上で均一なtethered膜の作製を行い、膜貫通ヘリックス間相互作用による側方拡散抑制を測定しproof of conceptを行う。次に、(KR)3のような親水性タグを末端に付加した膜貫通ヘリックスを合成し、会合のトポロジー制御を試みる。さらに、GUVに組み込んだazide標識膜貫通ヘリックスを用いてtethered膜形成ができないか検討する。親水性タグ付加膜貫通ヘリックスを用いる事でGUV上でも会合トポロジー制御が可能である。GUVの代わりに細胞も用いて検討する。これらを通して、膜内タンパク質補足計測法技術を確立する。