2016 Fiscal Year Research-status Report
DNAアプタマーを 分子認識素子とする次世代医薬の革新的臨床分析法の開発
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16K08200
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
轟木 堅一郎 静岡県立大学, 薬学部, 准教授 (70341451)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 秀樹 岐阜薬科大学, 薬学部, 准教授 (00419665)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 抗体医薬 / アプタマー / バイオアナリシス / HPLC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は，我々が見出した抗体医薬bevacizumabに対する抗イディオタイプDNAアプタマーを分子認識素子とし，磁気ビーズに固定化するアプタマーアフィニティー精製法を開発した。本精製法と，高温逆相LC（HT-RPLC）-自然蛍光検出法を組み合わせることで，血中bevacizumabのバイオアナリシス法を構築した。磁気ビーズへのアプタマー固定化法について検討した結果，磁気ビーズにはストレプトアビジン修飾ビーズを用い，ビオチン修飾DNAを結合させることとした。アプタマー結合磁気ビーズからのベバシズマブの溶出条件について検討した結果，最適溶出条件として10 M尿素と3 M NaCl含有溶液を用いたときに最大の回収率を与えた。FDAのバイオアナリシスのLCガイドラインに則った分析バリデーションを取得した結果，ベバシズマブ添加血漿試料において，1 - 50 μg/mLの範囲でr2 = 0.9993と良好な直線性を示し，LOD = 0.15 μg/mL，LOQ = 0.51 μg/mLと十分な感度が得られた。また，日内変動は2.3% - 5.5%，日間変動は3.0% - 6.2%以下といずれも優れた精度を示した。
さらに本アフィニティー磁気ビーズは血漿中のIgGのみならず他のIgG型抗体医薬も認識しなかったことから，本精製法がベバシズマブに対して非常に選択性が高いことが示された。
今回確立した分析法は，当研究室で開発したイムノアフィニティー精製-HT-RPLC分析法のみならず，既存のトリプシン消化-LC-MS/MS分析法と比較しても簡便性，汎用性，頑健性において優位性を示すと考えられ，今後，実検体分析への投入が期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概ね予定通りに進行している。また，他の市販抗体医薬および抗体薬物複合体を特異的に認識するアプタマーについても現在探索中であり，近く候補化合物を導出予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
抗イディオタイプDNAアプタマーを用いるハイスループットなLBAであるEnzyme-Linked Aptamer Assay（ELAA）法を開発する。従来のELISA法などのLBAと異なり，本法では化学的に安定なDNAアプタマーをベバシズマブの捕捉分子として用いているため，抗体の質に依存しない安定な分析法となりうる。さらに，アプタマーによる抗体医薬の分子認識と酵素反応を組み合わせた，自己血糖測定器（PGM）によるポイントオブケア診断法（POCD）についても開発する。
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| Causes of Carryover |
当初の購入予定であった試薬の納期が変更になり、購入できなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度に購入できなかった試薬の購入に充てる。
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[Journal Article] Bioanalysis of bevacizumab and infliximab by high-temperature reversed-phase liquid chromatography with fluorescence detection after immunoaffinity magnetic purification2016
Author(s)
Kenichiro Todoroki, Tatsuki Nakano, Yasuhiro Eda, Kaname Ohyama, Hideki Hayashi, Daiki Tsuji, Jun Zhe Min, Koichi Inoue, Naoki Iwamoto, Atsushi Kawakami, Yukitaka Ueki, Kunihiko Itoh, Toshimasa Toyo'oka
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Journal Title
Analytica Chimica Acta
Volume: 916
Pages: 112-119
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-Methylmor- pholinium Chloride as an Enantioseparation Enhancer for Chiral Derivatization-LC Analysis of D- and L-Amino acids2016
Author(s)
Kenichiro Todoroki, Misuzu Nakamura, Yuhi Sato, Kanoko Goto, Tatsuki Nakano, Yasuhiro Ishii, Jun Zhe Min, Koichi Inoue, Toshimasa Toyo'oka
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Journal Title
Chromatography
Volume: 37
Pages: 23-28
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Simultaneous and rapid determination of gefitinib, erlotinib and afatinib plasma levels using liquid chromatography/tandem mass spectrometry in patients with non-small-cell lung cancer2016
Author(s)
Hideki Hayashi, Yutaro Kita, Hirotoshi Iihara, Koumei Yanase, Yasushi Ohno, Chiemi Hirose, Maya Yamada, Kenichiro Todoroki, Kiyoyuki Kitaichi, Shinya Minatoguchi, Yoshinori Itoh, Tadashi Sugiyama
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Journal Title
Biomedical Chromatography
Volume: 30
Pages: 1150-1154
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Diagnostic approach to breast cancer patients based on target metabolomics in saliva by liquid chromatography with tandem mass spectrometry2016
Author(s)
Takahiro Takayama, Haruhito Tsutsui, Ippei Shimizu, Tatsuya Toyama, Nobuyasu Yoshimoto, Yumi Endo, Koichi Inoue, Kenichiro Todoroki, Jun Zhe Min, Hajime Mizuno, Toshimasa Toyo'oka
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Journal Title
Clinica Chimica Acta
Volume: 452
Pages: 18-26
DOI
Peer Reviewed
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