2016 Fiscal Year Research-status Report
キャピラリーアレー型アフィニティー電気泳動による糖タンパク質糖鎖の迅速分析
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16K08209
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
鈴木 茂生 近畿大学, 薬学部, 教授 (00154542)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | キャピラリー電気泳動 / 糖タンパク質糖鎖 / 自動分析 / レクチン / エキソグリコシダーゼ / 糖タンパク質性医薬品 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究課題に従って、(1)部分導入キャピラリー電気泳動による糖タンパク質糖鎖の解析に必要な認識タンパク質の拡張、ならびにオンライン糖鎖標識体調製法としての(2)オンライン酵素反応、(3)オンライン標識化、(4)糖鎖誘導体のオンライン精製、および、(5)これら組み合わせによる統合システムの開発を行っている。
(1)については、糖鎖認識タンパク質であるレクチンや糖鎖抗体については例外なく適用できることを実証したが、数種類のエキソグリコシダーゼについては、部分導入による酵素消化が難しいもの(マンノシダーゼ、N-アセチルヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼ)があった。今回はキャピラリー酵素消化条件における電位設定等を工夫することで、糖タンパク質糖鎖の構造解析に必要な全てのエキソグリコシダーゼについて、その消化条件を確立し、成果を専門誌上に発表した。
(2)～(3)については、ナノリットルスケールでの溶液のハンドリングが必要となるが、本研究採択予算で購入した新たな機器を使って様々な方法を検討した結果、研究の方向性を決定することができた。
(4)については、7-amino-4-methylcoumarinと2-aminopyridineという、従来は非常に精製が困難な誘導体をモデルに選び、スケール的にはマイクロリットルオーダーのHPLCにおいてオンライン精製を検討した。その結果通常の分析時間に数分の時間を加えるだけで、自動的に糖鎖誘導体を調製できるシステムを確立し、既に学会発表を済ませ、その内の一つについては専門誌へ報告した。
今後は、(1)および（4）の成果を統合して、(2)および(3)の完成を目指し、統合システム開発を推し進める予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究課題は、(1)部分導入キャピラリー電気泳動による糖タンパク質糖鎖の解析に必要な認識タンパク質の拡張、オンライン糖鎖標識体調製法としての(2)オンライン酵素反応、(3)オンライン標識化、(4)オンライン糖鎖誘導体精製および、これら組合せによる(5)統合システムの開発からなる。（１）についてはほぼ完成し、かなり複雑な糖鎖混合物に対してもそれぞれの分離成分ごとに定量分析と構造情報を得ることができる上、質量分析など現在主流となっている方法では不可能な0.5%未満の微量成分に対しても精度の高い解析が可能であることを報告した。
一方、(4)に関しては、まだマイクロリットルオーダーであり目的とするシステムの100倍ほど、大きなスケールではあるが、従来は精製が困難とされてきた7-amino-4-methylcoumarinおよび2-aminopyridine誘導体のオンライン精製法を確立し、数分で定量的に誘導体を精製・分離出来きることを報告した。
(2)および（3）については、現在装置等のセットアップが完成し、評価を行っている段階まで到達しており、次年度以降に成果が発表できると思われる。また、これらに関しは予想以上の成果も得ており、本年度中には成果を報告できると考えている。
よって概ねではあるが、当初の目的通りに研究計画が推移していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在のところ順調に推移しており、問題は発生しないと考えている。
今年度の目標はオンライン糖鎖標識体調製法としての(2)オンライン酵素反応、(3)オンライン標識化に着手し、ナノリットルオーダーでの酵素反応、誘導体化反応、誘導体化混合物からの糖鎖誘導体の精製条件を確立することに重点的に取り組む。本研究課題予算で購入した装置のセットアップ等は完成しており、今後、評価を含め、反応をいかに効率よく進めるかについて重点的に取り組む予定である。本研究ではナノリットルオーダーでの反応など、申請者が体験してない体積領域での研究に着手することになる。既に先行研究がいくつか報告されており、これらを参考にしたい。また、ナノリットルオーダーの液量をハンドリングするには、専用のミクロ流体系流路を作成、利用する必要が起こり得る。これらについては、京都大学工学部、大阪産業総合研究所等に相談し、研究を進める予定である。
(2)、（3)について、本年度中に条件等を確立し、最終的な流路デザインも含めて最終年度の研究へとつなげる。。その上で、(1)から(4）を統合し、最終年度にはこれらを統合してキャピラリー電気泳動に組み込む予定である。
また、研究成果として2-aminopyridine標識オンライン精製HPLCについても、現在、論文の推敲を重ねており、近々に専門誌への投稿を予定している。
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| Causes of Carryover |
当該年度における研究成果は、既に所有していた装置を使って得られたものである。今回の申請内容に含まれる研究として新たに始めた実験項目に関しては、装置の導入が海外からの輸入ということもあり、大幅に遅れたてしまった。そのために装置のセットアップで年度末を迎えた。
したがって、当初の計画では、試料、試薬として計上していた予算がそのまま次年度繰越となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記の通り、本研究遂行に当たって必要な、試薬類を未だ購入していないので、残予算の大半はこれらの購入に充てる予定である。特に、誘導体化試薬や酵素類は高額なものが多く、現状では繰越残高がなければ、遂行は困難である。
本申請に当たっては、2年目が50万円、3年目が30万円と初年度に比べて少額であり、初年度に偏った予算配分で申請を行っている。したがって、当然ではあるが、これ以上の額が次年度以降に繰り越されることはない。
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Research Products
(11 results)
