2016 Fiscal Year Research-status Report
線虫ダイサー関連ヘリカーゼの生化学的研究と抗線虫薬創出への応用
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16K08229
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| Research Institution | Toyohashi University of Technology |
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Principal Investigator |
浴 俊彦 豊橋技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (40192512)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ダイサー関連ヘリカーゼ / 線虫 / 抗線虫薬 / 核酸依存性ATPase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、申請者が独自に発見した線虫の染色体動態制御に関与する新規ダイサー関連ヘリカーゼDRH-3とその結合タンパク質E1、およびDRH-3のパラログであるDRH-1の生化学的性状解析と創薬応用を目指している。本年度実施した主な研究内容と結果を以下に示す。
１．DRHとE1タンパク質の調製：多種の変異型DRH-3タンパク質を調製するための簡便な一段階精製法として、アフィニティクロマトグラフィー装置によるHisタグ融合DRH-3タンパク質精製法の条件検討を行った。DRH-1については、DRH-3と同様の条件で発現・精製を試みたが、可溶化タンパク質の発現は確認できなかった。そこで、コドン最適化drh-1op遺伝子を調製、発現コンストラクトを作製して宿主等の条件を検討した結果、可溶化Hisタグ融合DRH-1を少量ではあるが調製できる可能性が示された。一方、欠失変異型GSTタグ融合E1の調製に関しては、発現コンストラクト12種類を構築し、発現確認を進めた結果、多くが不溶化する傾向が認められ、可溶化についての課題が明らかになった。
２．DRHアッセイ法の確立： ATPase活性測定法については、大腸菌RecAタンパク質を用いて、非RIの蛍光法によるアッセイ系の確立と評価を行った。本系を用いて、アフィニティ精製したHisタグ融合DRH-3標品において、二本鎖RNAで促進されるATPase活性の検出に成功した。今後、精製度を上げたDRH-3を用いてアッセイ系の最適化を行う必要がある。本研究と直接関係はしないが、本法のノウハウを利用して新たな酸化ストレス検出系を開発し、成果を発表した。
３．DRH-1結合タンパク質の探索：RDE-4、ERI-5など4種類の候補タンパク質のクローニングを完了した。塩基配列解析の結果、ERI-5の2箇所に点変異が確認されたので、校正を行う必要がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度計画の主な目標として、（1）DRH-1, DRH-3, E1等タンパク質の調製法を確立すること、（2）核酸依存性ATPaseアッセイ法を確立すること、（3）DRH-1結合候補タンパク質のクローニングと発現コンストラクトを構築すること、（4）サンドイッチ法によるタンパク質間相互作用アッセイ法を開発することを掲げた。そのうち、4番目の項目については、専用プレートリーダーを予算的に購入することができなかったため、計画を変更してプルダウン法のみで研究を進めることにした。項目1から3については、発現コンストラクトの作製がほぼ予定通り進行し、DRH-3標品における二本鎖RNA依存的なATPase活性を検出するなどの成果が得られており、計画通り進んでいる。とくに当初、難航が予想されていたDRH-1タンパク質の調製については、コドン最適化と発現条件の検討により、可溶化DRH-1を調製できる可能性が示唆されたのは大きな進展である。一方、変異型E1タンパク質の不溶化については、新たなタグ融合タンパク質発現系を検討するなどの対応が必要となった。そのため、タンパク質間相互作用解析については、今後、計画の変更を迫られる可能性もある。
以上の結果から、研究は概ね計画通りに進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の成果と課題を踏まえて、今後の研究は以下の項目に沿って推進する。
１．DRH-1の精製法を確立する。DRH-1の回収量がDRH-3に比較して少ないので、N末にSUMOタグを付加するなどにより、発現量と可溶性の向上を検討する。DRH-3については、アフィニティ精製条件の最適化を継続する。
２．精製したDRH-1とDRH-3標品の核酸依存性ATPase活性の測定を行う。再現性の確認、およびアッセイ系の最適化（pHや塩濃度、二価イオン濃度など）を行い、核酸特異性などの生化学的特性や酵素学的パラメータの解析を行う。あわせて点変異型DRHを調製し、酵素触媒に関与するアミノ酸残基を同定する。とくにDRH-1の精製と酵素学的解析は世界初の成果になると期待されるので、優先して研究を推進する。
３．変異型E1を可溶化するための菌株や培養条件を検討する。部分的に可溶化できた変異型E1を用いて、Hisタグ融合DRH-3とのプルダウン実験を開始し、DRH-3と結合するE1領域の特定を進める。並行して、DRH-1結合候補タンパク質の発現の検証と精製条件の検討を開始し、DRH-1やDRH-3との結合性をプルダウン法で評価する。E1タンパク質の解析については、生化学的解析よりも相互作用解析を優先させて研究を進める方針である。
４．DRH-3標品を用いたATPase活性測定系を用いた阻害剤のスクリーニング系について検討を開始する。研究成果はまとまり次第、学会等で発表してゆく。
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