2016 Fiscal Year Research-status Report
ウェルナー症候群由来ｉＰＳ細胞を用いた病態解析と治療技術の開発
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16K08234
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
嶋本 顕 広島大学, 医歯薬保健学研究院(薬), 准教授 (70432713)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 早老症 / 細胞老化 / 間葉系幹細胞 / p21 / p16 / SA-β-gal |
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| Outline of Annual Research Achievements |
健常者iPS細胞として201B7及び253G1、患者iPS細胞として WSCU01-iPSC02、WSCU01-iPSC13を用いて、コラーゲンフィブリルを基質とした方法を一部改変して分化誘導実験を行なった。その結果、それぞれからMSC様細胞2M7, 25M4, WM23, WM21を樹立することに成功した。そしてこれらのMSC様細胞において、MSC特異的マーカーであるCD73, CD90, CD105については細胞集団の90%以上が陽性であり、さらに血球系幹細胞マーカーであるCD34, CD45が陰性であることをFACSにて確認した。
さらに、間葉系幹細胞の分化能の指標である骨、軟骨、脂肪細胞への分化能について分化誘導キットを用いて検討したところ、これら全てのMSC様細胞から骨、軟骨、脂肪細胞を誘導することができた。以上の結果から、健常者及び患者由来のiPS細胞4株からiPS細胞由来MSC(iMSC)を作製することに成功した。
次にMSCの早期老化がウェルナー症候群の病態を決定づける因子である可能性を検討するために、各々のiMSCを複製老化に至るまで継代培養した。その結果、2M7, 25M4, WM23, WM21各々において、増殖停止に至ったPDLは26, 21, 19, 53であった。qRT-PCRの発現解析から、CDKi p21の発現はWM21において他の細胞に比して著しく低く、CDKi p16はWM23において最も高発現であった。タンパク質レベルでは、WM23, WM21においてp53が高発現であり、p21はWM23で高発現、WM21で低発現であった。p16の発現レベル、及びSA-β-gal染色では明らかな差は見られなかった。以上から、WM23はやや早期老化傾向を示したものの、WM21は正常iMSCよりも寿命が延長しており、今後更なる解析が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
多能性幹細胞からMSCを分化誘導するプロトコルはいくつか論文として発表されているが、論文に即して実際に行ってみるとiPS細胞からMSCを分化誘導する条件がiPS細胞の株によって若干異なることが経験的にわかった。同じプロトコルで行った場合でも、間葉系幹細胞の形態を示す細胞に混じって上皮系細胞の混入が顕著な株や、分化誘導過程で著しい細胞死を引き起こす株があった。このような場合には細胞外基質条件や培養液組成を変更して分化誘導実験を繰り返し、時間を掛けて条件の至適化を行うことによりそれぞれのiPS細胞株に適した分化誘導条件を確立することができた。
また、ヒト正常細胞として実験によく使われている線維芽細胞の倍加時間は1-3日程度であるが、MSCは5日から1週間以上の倍加時間であり、分裂寿命の検討にかなり時間を要する結果となった。
さらに、患者iPS細胞由来MSCの分裂寿命は健常者iPS細胞由来のものより短いとの予想の下に本研究を開始したが、これに反して患者iMSCの中には健常者iMSCよりも長い分裂寿命を呈したものがあり、今後の研究方針に影響を与える可能性がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
健常者2株のiMSCが増殖停止に至ったPDLは26及び21であり、患者2株のiMSCが増殖停止に至ったPDLは 19及び 53であった。患者由来線維芽細胞の分裂寿命が健常者の半分程度であることを考慮すれば、分化誘導条件や培養条件がiMSCに適していないこと、或いは症例数が少ないことなどがこの理由として考えられる。したがって、来年度はさらに分化誘導に用いる健常者並びに患者由来iPS細胞株を増やし、分化誘導実験を進める予定である。
また、患者iPS細胞由来MSCの分裂寿命は健常者iPS細胞由来のものより短いとの予想の下に本研究を開始したが、これに反して患者iMSCの中には健常者iMSCよりも長い分裂寿命を呈したものがあった。ウェルナー症候群は染色体不安定性でがん多発疾患であり、とくに間葉系細胞由来の肉腫の発症が多く報告されていることから、分裂寿命が長い患者iMSCはウェルナー症候群の肉腫発症モデルとなりうる可能性がある。来年度はこの点も考慮して遺伝子発現解析等の実験を行う予定である。
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