2017 Fiscal Year Research-status Report
微生物接着シグナルによる粘膜免疫誘導機構の解明と粘膜アジュバント開発への応用
| Project/Area Number |
16K08241
|
|---|
| Research Institution | Gifu Pharmaceutical University |
|---|
Principal Investigator |
杉山 剛志 岐阜薬科大学, 薬学部, 准教授 (70268001)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上田 浩 岐阜大学, 工学部, 教授 (50253779)
高橋 圭太 岐阜薬科大学, 薬学部, 助教 (50634929)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 腸管出血性大腸菌 / シトロバクター・ローデンティウム |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
シトロバクター・ローデンティウムのTir欠損菌株を、Tirまたはその変異体を発現する腸管上皮細胞株に感染・接着させることで、アクチン重合を起こす場合と起こさない場合の感染状態をin vitroで再現し、宿主細胞の遺伝子発現を検討した。マウス腸管上皮細胞株CMT-93に、哺乳動物細胞の発現ベクターに組込んだTir全長またはC末端側ドメイン欠損Tirをトランスフェクションして発現させ、野生株またはTirのIntimin結合ドメインを欠損した変異株を感染させた。感染細胞からtotal RNAを抽出し、qRT-PCR法によって種々の遺伝子発現量を測定したところ、CXCL1等、アクチン重合を誘導する接着に比べ誘導しない接着の場合に発現が高いもの、TGF-β等、感染時全てで発現が高いもの、MIP-1α等、アクチン重合を誘導する接着の場合に発現が高いものなどがみられた。
Rac1およびCdc42を活性化するRhoGEFであるKIAA0599のTLRシグナルへの影響を検討したところ、TRIF依存的シグナルを増強することを見出した。この活性化増強は、RhoA、Rac1またはCdc42の不活性型変異体を共発現させても抑制されなかった。さらに、KIAA0599のRho GTPase活性化ドメイン欠失変異体でも増強活性がみられた。よって、KIAA0599はRho GTPaseの活性化とは無関係にTRIF依存的シグナルを増強すると考えられた。また、Cdc42を活性化するRhoGEFであるKIAA0362についても検討し、やはりRho GTPaseの活性化を介することなくTLRシグナルのTRIF依存的経路に関与するリン酸化IRF-3によるPRD III/Iプロモーターの転写活性を増強することを見出した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初、平成29年度に予定していたin vitroでの検討は感染細菌を腸管出血性大腸菌から、同様にIII型分泌機構によってA/E病変を引き起こすシトロバクター・ローデンティウムに変更して行い、ほぼ予定通りに遂行できた。また、同様に平成29年度に予定していたRhoGEFおよびRho GTPaseの細胞内発現による細胞応答についての検討の一部は昨年度に行っており、当初の平成29年度の研究計画はほぼ予定通りに遂行された。しかし、平成28年度に予定していたin vivoの検討について、腸管出血性大腸菌に加えてシトロバクター・ローデンティウムの変異株を作成して検討することを試みたが、両者とも当初予定の変異株の一部の作成には成功したが、動物実験を行うために必要な一連の変異株をそろえることができなかった。したがって、動物実験の内容の大半を行うことができず、来年度に繰り越さざるを得なくなった。しかし、腸管感染において問題となる腸内細菌叢の状態について検討を行い、一定の腸内細菌叢を持つ動物実験系を作製する手法をほぼ確立することができた。また、Cdc42以外のRho GTPaseを活性化するRhoGEFの機能についても検討が進んでいる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
引き続きシトロバクター・ローデンティウムおよび腸管出血性大腸菌の変異株の作製を行い、in vitroにおいて接着、A/E病変およびアクチン重合の有無を、共焦点レーザー蛍光顕微鏡等を用いて確認する。その後、in vivo感染実験を行い、変異株とIgA産生との関係を解析する。in vitroの検討について、平成29年度に行った、シトロバクター・ローデンティウムのマウス腸管上皮細胞株への接着による種々の遺伝子発現の検討をさらに進め、腸管出血性大腸菌の変異株でも同様に接着による遺伝子発現を確認するとともにタンパク質レベルでの発現も確認する。
シトロバクター・ローデンティウムおよび腸管出血性大腸菌の接着・アクチン重合時の遺伝子発現と、Cdc42を活性化するFLJ00018、KIAA1209および新規にクローン化したRhoGEF、またはCdc42類縁のRho GTPaseの常時活性型変異体を過剰発現させたCMT-93細胞を種々のTLRリガンドで刺激した場合の遺伝子発現とを比較し、類似の遺伝子発現パターンを示すRhoGEFを検索する。RhoGEFまたはRho GTPase発現の有無およびTLRリガンド刺激の有無による遺伝子発現の違いをRT-PCRおよびレポーターアッセイにより検討する。さらにその上流および下流のシグナル経路の解析を行い、in vivoの結果と合わせて特異的IgA産生との関連を考察する。
|
| Causes of Carryover |
平成29年度に一部の動物実験による条件検討を行い、腸管出血性大腸菌およびシトロバクター・ローデンティウムの変異株の作成については、当初予定の一部の変異株を作成することはできたが、感染実験を行うために必要な一連の変異株をそろえることができなかった。したがって、動物実験の内容の大半を行うことができず、平成30年度に先送りした。よって動物実験に使用を予定していた予算の一部を平成30年度使用額として残留した。
引き続き行っているシトロバクター・ローデンティウムおよび腸管出血性大腸菌の一連の変異株の作製が終了し次第、これらの変異株を用いた感染実験を行うために使用する。感染実験はP3A実験施設において行い、変異株をマウスへ経口摂取して約4週間、血清及び糞便を採取して抗体産生の上昇を調べる。腸管出血性大腸菌およびシトロバクター・ローデンティウムの検討で抗体価の測定のほか、各消化管組織での菌の定着の度合い、免疫細胞の動向等の検討を行うため複数回の実験が必要と考えており、これら一連の動物実験に繰り越した研究費を使用する。
|
