2019 Fiscal Year Annual Research Report
A study of functional roles of SV40 microRNA in cell transformation.
Project/Area Number |
16K08250
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Research Institution | Musashino University |
Principal Investigator |
土方 貴雄 武蔵野大学, 薬学部, 教授 (70189786)
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Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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Keywords | マイクロRNA / miR-S1 / SV40 / hsa-miR-1266 |
Outline of Annual Research Achievements |
本研究計画に用いる細胞の選定として各種細胞株についてTERTとhsa-miR-1266の発現解析を行い、解析に資する細胞としてHEK293(ヒト胎児腎由来)、A549(ヒト肺癌由来)とBxPC3(ヒト膵臓癌由来)、初代培養細胞株のHDF(ヒト皮膚由来繊維芽細胞)を以後の解析に用いた。レポーターアッセイおよびイムノブロッティングにより、miR-1266導入によってTERT-3’UTRレポーター活性とTERTタンパク発現が減少し、この減少はmiR-S1を同時に導入する事で競合的に抑制される事が示された。また、miR-S1のみを導入する事でもTERTタンパクレベルは上昇(内因性miR-1266に干渉)する点が確認された。ビオチン化miR-S1を用いたプルダウンアッセイ/qPCRにより、miR-1266-5pとmiR-S1-3pの直接的な結合が明らかになり、更にmiR-S1-3pに結合するマイクロRNAとしてhsa-miR-138-5pとhsa-miR-152-3pを見出した。FACS解析により、miR-S1導入はbasalなアポトーシス細胞数およびdoxorubicinによるアポトーシス誘導を有意に減少させる事が明らかになった。以上より、SV40-miR-S1はmiR-1266と相補的に結合し、その機能を不活化させる事によりヒト宿主細胞のTERT発現制御に干渉し、結果として正常細胞の形質転換(不死化)等に寄与する可能性を提示できた。一方、miR-1266を発現しないマウスの胎児線維芽細胞に野生型SV40およびmiR-S1発現欠損SV40 を感染させたところ、いずれの感染細胞も形質転換しその細胞培養上清には感染能をもつSV40の放出が見られた。これら結果はマウス細胞ではSV40による形質転換と宿主への感染性に関してmiR-S1の寄与は非常に少ないことを示唆する。
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