精巣由来の幹細胞特有に働くポリ(ADP-リボシル)化タンパクの同定

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08257
• Research Institution: Osaka Ohtani University
• Principal Investigator: 竹橋 正則 大阪大谷大学, 薬学部, 准教授 (10378862)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 黒川 優 大阪大谷大学, 薬学部, 助教 (70759761)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 精子幹細胞 / ポリ(ADP-リボシル)化

Outline of Annual Research Achievements

精子幹細胞の長期培養法が確立され、発生工学、不妊治療および再生医療への利用が期待されている。マウス神経幹細胞やマウス精子幹細胞の長期培養系（GS細胞）を用いたこれまでの研究によって、遺伝子発現制御、DNA修復、染色体の安定性などとの関連が知られているタンパク質翻訳後修飾、ポリ(ADP-リボシル)化がこれら組織幹細胞の増殖や細胞死、DNAのメチル化などに関与する可能性があることを明らかにした。本研究の目的は、GS細胞特有に働くポリ(ADP-リボシル)化タンパク質を同定し、GS細胞におけるポリ(ADP-リボシル)化の役割をさらに詳細に解明することである。
前年度に引き続き、マウス胎児線維芽細胞と比較してGS細胞特有に働くポリ(ADP-リボシル)化タンパク質を同定するために、それぞれの細胞から抽出したタンパク質を、ポリ(ADP-リボース)に対する種々の抗体を用いた免疫沈降法ならびに、ポリ(ADP-リボース)親和性レジン、その他の方法を用いてポリ(ADP-リボシル)化タンパク質の分離条件の検討を行った。さらに、マウス精子幹細胞由来の多能性幹細胞（多能性精子幹細胞：mGS細胞）の抽出タンパク質もサンプルとして用いた検討も行い、精子幹細胞の多能性獲得とポリ(ADP-リボシル)化の関係を明らかにしようとした。それぞれの細胞の培養条件、タンパク質抽出のタイミング、タンパク質抽出法などについての条件も変えながら、この分離したタンパク質から、GS細胞もしくはmGS細胞特有に働く、ポリ(ADP-リボシル)化タンパク質の候補を絞り込むための解析法の検討についても進めた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

GS細胞特有に働くポリ(ADP-リボシル)化タンパク質の明確な候補を絞り込むことを目的にしていたが、そこまでに至っていない。

Strategy for Future Research Activity

GS細胞特有に働くポリ(ADP-リボシル)化タンパク質の明確な候補を絞りこむことができれば、その候補分子について、遺伝子ノックダウンまたは過発現系、さらにはタンパク機能に関連した種々の変異体を構築し、GS細胞の増殖やDNAのメチル化などの表現型に変化が生じるかについて解析する。
上記の研究がうまく進まない場合は、体細胞に比べてGS細胞でPARP発現が高いことがストレス耐性に関与するかについて、これまでに構築しているPARPの活性および発現を制御したGS細胞と野生型GS 細胞とを比較することによって、各種ストレス下におけるポリ(ADP-リボシル)化反応の役割について解析する。

Causes of Carryover

本年度中に、GS細胞特有に働くポリ(ADP-リボシル)化タンパク質の明確な候補を絞り込むことを目的にしていたが、そこまでに至らなかった。このように実験計画が遅れ、予定していた実験が実施できなっかたため。
この研究費と次年度請求する研究費を合わせて、主にタンパク質解析、細胞培養および一般研究用の試薬、培養用のプラスチック器具などの消耗物品費に使用し、一部、成果発表のための旅費および投稿料などに使用する予定である。