O-マンノース型糖鎖生合成経路の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08262
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology
• Principal Investigator: 遠藤 玉夫 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 副所長 (30168827)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 糖鎖 / O-マンノース / 筋ジストロフィー

Outline of Annual Research Achievements

α－ジストログリカノパチー(α-DGpathy)は筋異常に加え中枢神経系の異常を伴う最重症タイプの先天性筋ジストロフィー症の一群で、α－ジストログリカン(α-DG)のO-マンノース（Man）型糖鎖不全を原因とする。病態の中心はα-DGと細胞外マトリックス分子との結合障害であり、この結合はグルクロン酸（GlcA）とキシロース（Xyl）からなる繰り返し構造（GlcA-Xylリピート）を介している。
我々は、GlcA-XylリピートがO-Man型糖鎖のコアM3構造に2個のリビトール5リン酸（Rbo5P）を介して結合していること、この構造がα-DGpathyの原因遺伝子fukutin、FKRP、ISPDによって合成されることを明らかにした。これにより、O-Man型糖鎖のコアM3構造の全体像がほぼ分かってきた。しかし、この構造中のXyl-Rbo5Pの結合様式とその合成酵素は未解明であった。TMEM5はα-DGpathyの原因遺伝子の一つで、O-Man型糖鎖の生合成に関わる可能性が示唆されていたが機能は不明であった。また、別のα-DGpathyの原因遺伝子であるPOMGNT1はO-Man型糖鎖のGlcNAcβ1-2Man（コアM1）の合成酵素であり、その触媒活性はコアM3構造の合成には関与しない。しかし、POMGNT1の変異はコアM3構造上のGlcA-Xylリピートを消失させることから、POMGNT1によるコアM3合成制御機構の解明は病態を理解する上で重要である。今年度、我々はTMEM5とPOMGNT1の機能を解析し、TMEM5がXyl-Rbo5Pの合成を担うXyl転移酵素であること、POMGNT1は触媒ドメインと糖結合ドメインの2つの機能ドメインを持ち、糖結合ドメインがGlcA-Xylリピートの形成に必要であることを明らかにし、コアM3構造とその生合成経路の全容を解明した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、TMEM5がO-Man型糖鎖の生合成に関わるXyl転移酵素であることを明らかにした。GlcA-Xylリピートは糖転移酵素LARGEにより形成されるが、最初のXylはLARGEでは転移できず、リピートの伸長にはTMEM5が必須であることが示された。また、POMGNT1は触媒ドメインと糖結合ドメインの2つの機能ドメインを持ち、糖結合ドメインがコアM3合成に必要であることを明らかにした。これらの成果により、コアM3 O-Man型糖鎖の構造と生合成経路の全容が解明できた。

Strategy for Future Research Activity

近年、α－ジストログリカノパチーの原因遺伝子が多数報告され、O-Man型糖鎖に多様な構造が存在することが明らかになってきた。また、原因遺伝子により症状に差異が認められており、こうした症状の差異とO-Man型糖鎖の構造多様性との関連が指摘されている。しかしながら、こうした多様な糖鎖構造の機能や病態との関係や、多様な糖鎖構造の生理機能や修飾を制御するメカニズムは不明である。したがって、生合成に関わる糖転移酵素の詳細な機能解析は、各原因遺伝子の変異と病態の関係を明らかにするために必要である。そこで本研究では、以下の実験を計画している。
（1）タンパク質上のO-Manに対してGTDC2は小胞体でコアM3を合成し、POMGnT1はゴルジ体でコアM1を合成することから、GTDC2によるコアM3形成に優先性がある。構築した酵素測定法を利用しKmなどそれぞれの酵素の諸性質を明らかにする。基質特異性を詳細に調べることによりPOMGnT1とGTDC2の性質の違いを明らかにする。
(2) X線構造解析により各原因遺伝子産物（糖転移酵素）を詳細に解析し、糖鎖生合成のメカニズムと患者変異による発症のメカニズムを検討する。また、CRISPR-Cas9システムにより疾患原因遺伝子および関連遺伝子を欠損させた細胞株を作製し、O-Man型糖鎖（コアM3）欠損の影響と糖鎖の機能を細胞レベルで解析する。
（3）POMGnT1ノックアウト細胞に幹領域を欠損したPOMGnT1、糖認識アミノ酸置換体POMGnT1など様々な変異体を発現させ、コアM3の糖鎖が伸長するかどうか調べる。POMGnT1のどの領域が重要であるかなども含めPOMGnT1によるコアM3伸展の制御機構を明らかにする。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた理由としては、試薬類の購入が予定より若干少なかったことがあげられる。年度を跨いだ発注ができないため、年度末の発注を控えたためである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

これらの金額と次年度以降に請求する研究費を合わせた使用計画としては、昨年度購入できなかった試薬類の購入にあてる。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Baylor College of Medicine(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: Baylor College of Medicine
• [Int'l Joint Research] Peking Union Medical College/Peking University First Hospital(China)
  • Country Name: China
  • Counterpart Institution: Peking Union Medical College/Peking University First Hospital
• [Int'l Joint Research] McGill University Health Centre(Canada)
  • Country Name: Canada
  • Counterpart Institution: McGill University Health Centre
• [Int'l Joint Research] Hadassah-Hebrew Univ. Medical Center(Israel)
  • Country Name: Israel
  • Counterpart Institution: Hadassah-Hebrew Univ. Medical Center
• [Journal Article] The muscular dystrophy gene TMEM5 encodes a ribitol β1,4-xylosyltransferase required for the functional glycosylation of dystroglycan. (2016)
  • Author(s): Manya, H., Yamaguchi, Y., Kanagawa, M., Kobayashi, K., Tajiri, M., Akasaka-Manya, K., Kawakami, H., Mizuno, M., Wada, Y., Toda, T., Endo, T.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 291 Pages: 24618-24647
  • DOI: 10.1074/jbc.M116.751917
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Carbohydrate-binding domain of the POMGnT1 stem region modulates O-mannosylation sites of α-dystroglycan. (2016)
  • Author(s): Kuwabara, N., Manya, H., Yamada, T., Tateno, H., Kanagawa, M., Kobayashi, K., Akasaka-Manya, K., Hirose, Y., Mizuno, M., Ikeguchi, M., Toda, T., Hirabayashi, J., Senda, T., Endo, T., Kato, R.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume: 113 Pages: 9280-9285
  • DOI: 10.1073/pnas.1525545113
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Analysis of phenotype, enzyme activity and genotype of Chinese patients with POMT1 mutation. (2016)
  • Author(s): Yang, H., Manya, H., Kobayashi, K., Jiao, H., Fu, X., Xiao, J., Li, X., Wang, J., Jiang, Y., Toda, T., Endo, T., Wu, X., Xiong, H.
  • Journal Title: J. Hum. Genet. Volume: 61 Pages: 753-759
  • DOI: 10.1038/jhg.2016.42
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Mutations in POMGNT1 cause non-syndromic retinitis pigmentosa. (2016)
  • Author(s): Xu, M., Yamada, T., Sun, Z., Eblimit, A., Lopez, I., Wang, F., Manya, H., Xu, S., Zhao, L., Li, Y., Kimchi, A., Sharon, D., Sui, R., Endo, T., Koenekoop, R. K., Chen, R.
  • Journal Title: Hum. Mol. Genet. Volume: 25 Pages: 1479-1488
  • DOI: 10.1093/hmg/ddw022
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] 筋ジストロフィー症原因遺伝子TMEM5はジストログリカンの機能糖鎖修飾に必要なβ1,4-xylosyltransferaseをコードする (2017)
  • Author(s): 萬谷博、山口芳樹、金川基、小林千浩、田尻道子、赤阪-萬谷啓子、川上宏子、水野真盛、和田芳直、戸田達史、遠藤玉夫
  • Organizer: 日本薬学会第137年会.
  • Place of Presentation: 宮城県仙台市（仙台国際センター）
  • Year and Date: 2017-03-24 – 2017-03-27
  • Invited
• [Presentation] 新型の翻訳後修飾体「リビトールリン酸」の同定～修飾機序と筋ジストロフィー病態への関与～ (2016)
  • Author(s): 金川基、小林千浩、田尻道子、萬谷博、久我敦、山口芳樹、和田芳直、遠藤玉夫、戸田達史
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
  • Invited
• [Presentation] 糖転移酵素POMGnT1の機能同定と糖鎖認識機構解析 (2016)
  • Author(s): 桑原直之, 萬谷博, 山田健之, 舘野浩章, 金川基, 小林千浩, 萬谷-赤阪啓子, 弘瀬友理子, 水野真盛, 池口満徳, 戸田達史, 平林淳, 千田俊哉, 遠藤玉夫, 加藤龍一
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] αジストログリカン糖鎖のリビトールリン酸タンデム構造とその生合成機構 (2016)
  • Author(s): 小林千浩, 金川基, 田尻道子, 萬谷博, 久我敦, 山口芳樹, 萬谷-赤坂啓子, 古川潤一, 水野真盛, 川上宏子, 篠原康郎, 和田芳直, 遠藤玉夫, 戸田達史
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] O-マンノース型糖鎖の生合成と先天性筋ジストロフィー症 (2016)
  • Author(s): 萬谷博、赤阪-萬谷啓子、遠藤玉夫
  • Organizer: 首都大バイオコンファレンス2016
  • Place of Presentation: 東京都八王子市（首都大学東京）
  • Year and Date: 2016-11-18
• [Presentation] O-マンノース型糖鎖上に形成されるリビトールリン酸のタンデム構造とその生合成機構 (2016)
  • Author(s): 萬谷博、金川基、小林千浩、田尻道子、久我敦、山口芳樹、赤阪-萬谷啓子、古川潤一、水野真盛、川上宏子、篠原康郎、和田芳直、戸田達史、遠藤玉夫
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 宮城県仙台市（仙台国際センター）
  • Year and Date: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [Presentation] 糖転移酵素POMGnT1の糖鎖認識機構解析 (2016)
  • Author(s): 桑原直之、萬谷博、山田健之、舘野浩章、金川基、小林千浩、赤阪-萬谷啓子、弘瀬友理子、水野真盛、池口満徳、戸田達史、平林淳、千田俊哉、遠藤玉夫、加藤龍一
  • Organizer: 第34回日本糖質学会年会
  • Place of Presentation: 高知県高知市（高知市文化プラザ かるぽーと）
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
• [Presentation] リビトールリン酸を含むO-マンノース型糖鎖の新奇構造と生合成機構. (2016)
  • Author(s): 萬谷博、金川基、小林千浩、田尻道子、久我敦、山口芳樹、赤阪-萬谷啓子、古川潤一、水野真盛、川上宏子、篠原康郎、和田芳直、戸田達史、遠藤玉夫
  • Organizer: 第34回日本糖質学会年会
  • Place of Presentation: 高知県高知市（高知市文化プラザ かるぽーと）
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
• [Presentation] αジストログリカン糖鎖のリビトールリン酸タンデム構造とその生合成経路 (2016)
  • Author(s): 小林千浩、金川基、田尻道子、萬谷博、久我敦、山口芳樹、赤阪-萬谷啓子、古川潤一、水野真盛、川上宏子、篠原康郎、和田芳直、遠藤玉夫、戸田達史
  • Organizer: 第2回日本筋学会
  • Place of Presentation: 東京都小平市（国立精神・神経医療研究センター）
  • Year and Date: 2016-08-05 – 2016-08-06
• [Presentation] α－ジストログリカノパチー原因遺伝子POMGNT1の変異による網膜色素変性症 (2016)
  • Author(s): 萬谷博、山田健之、遠藤玉夫
  • Organizer: 第2回日本筋学会
  • Place of Presentation: 東京都小平市（国立精神・神経医療研究センター）
  • Year and Date: 2016-08-05 – 2016-08-06
• [Presentation] A novel carbohydrate binding domain of the POMGnT1 stem region modulates Omannosylation sites of α-dystroglycan (2016)
  • Author(s): N Kuwabara, H Manya, T Yamada, H Tateno, Y Hirose, M Mizuno, M Ikeguchi, J Hirabayashi, T Senda, T Endo and R Kato
  • Organizer: 10th International GLYCO T 2016 Conference
  • Place of Presentation: Toronto, Canada
  • Year and Date: 2016-07-19 – 2016-07-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Processing of O-mannosyl glycan and its regulatory mechanism (2016)
  • Author(s): Tamao Endo
  • Organizer: 10th International GLYCO T 2016 Conference
  • Place of Presentation: Toronto, Canada
  • Year and Date: 2016-07-19 – 2016-07-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 糖転移酵素 POMGnT1 のステムドメインは糖鎖を認識し、O-Man 型修飾部位の制御を行う (2016)
  • Author(s): 桑原直之、萬谷博、山田健之、舘野浩章、弘瀬友理子、水野真盛、池口満徳、平林淳、千田俊哉、遠藤玉夫、加藤龍一
  • Organizer: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 福岡県福岡市（福岡国際会議場）
  • Year and Date: 2016-06-07 – 2016-06-09
• [Presentation] POMGNT1の変異が網膜色素変性症を引き起こす (2016)
  • Author(s): 山田健之、Mingchu Xu、萬谷博、Rui Chen、遠藤玉夫
  • Organizer: 第39回日本基礎老化学会大会
  • Place of Presentation: 神奈川県伊勢原市（伊勢原市民文化会館）
  • Year and Date: 2016-05-27 – 2016-05-28
• [Presentation] 糖鎖合成機構とその破綻による先天性筋ジストロフィー (2016)
  • Author(s): 遠藤玉夫
  • Organizer: 第63回 日本生化学会 近畿支部例会
  • Place of Presentation: 兵庫県神戸市（神戸薬科大学）
  • Year and Date: 2016-05-21
  • Invited
• [Presentation] 新規糖鎖ユニット“リビトールリン酸”の同定と筋ジストロフィーへの関与 (2016)
  • Author(s): 金川基、小林千浩、田尻道子、萬谷博、久我敦、山口芳樹、和田芳直、遠藤玉夫、戸田達史
  • Organizer: 第63回 日本生化学会 近畿支部例会
  • Place of Presentation: 兵庫県神戸市（神戸薬科大学）
  • Year and Date: 2016-05-21
• [Presentation] リビトールリン酸による糖鎖修飾の発見と筋ジストロフィーにおける欠損 (2016)
  • Author(s): 久我敦、金川基、小林千浩、田尻道子、萬谷博、山口芳樹、赤阪-萬谷啓子、古川潤一、水野真盛、川上宏子、篠原康郎、和田芳直、遠藤玉夫、戸田達史
  • Organizer: 第57回日本神経学会学術大会
  • Place of Presentation: 兵庫県神戸市（神戸コンベンションセンター）
  • Year and Date: 2016-05-18 – 2016-05-21
• [Presentation] 質量分析が明らかにしたリビトールリン酸を含むα-ジストログリカンの糖鎖構造 (2016)
  • Author(s): 田尻道子、金川基、小林千浩、萬谷博、久我敦、山口芳樹、赤阪-萬谷啓子、古川潤一、水野真盛、川上宏子、篠原康郎、遠藤玉夫、戸田達史、和田芳直
  • Organizer: 第64回質量分析総合討論会
  • Place of Presentation: 大阪府吹田市（ホテル阪急エキスポパーク）
  • Year and Date: 2016-05-18 – 2016-05-20