Quenchbodyを活用した迅速・簡便・高感度アルテミシニン免疫測定法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08296
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 田中 宏幸 九州大学, 薬学研究院, 准教授 (30253470)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: アルテミシニン / Artemisia annua / Quenchbody / イムノアッセイ

Outline of Annual Research Achievements

Artemisia annuaから発見されたアルテミシンは、マラリアの第一選択薬として広く使用されており、その安定供給が今後も重要な課題である。現在、生産性の向上を目指したアルテミシニン高含有品種の選抜育成が活発に進められている。上記育種研究において、アルテミシンの迅速、簡便、高感度な分析法は、優良品種の選抜に必須な技術である。本研究課題では、重要な天然化合物であるアルテミシニンの迅速・簡便・高感度分析法としてQuenchbody(Q-body)を活用したイムノアッセイの確立を企図した。これまでに、申請者はアルテミシン関連化合物を選択的に認識するモノクローナル抗体(MAb)の作製に成功し、競合的ELISAを開発している。本申請課題では、アルテミシニンのみを選択的に認識するMAbの作製を目指し、新規免疫原の調製を行った。適切に分子設計した新規ハプテンとタンパク質を結合させ、免疫原を調製後、マウスへ免疫原を投与した。続いて、血中抗体価の測定と抗体の各種関連化合物に対する選択性についてELISAによる評価を行ったところ、抗体価の上昇は確認できたものの、期待した極めて高い特異性を得ることが出来なかった。そこで、現在、以上の問題点を明確にするため、再度実験を繰り返している段階にある。
Q-bodyを活用したイムノアッセイの開発については、既に作製しているアルテミシニンおよびアルテスネートを認識するMAbの情報を基に、Q-bodyの作製を開始した。無細胞翻訳系を用いて、scFv、VH-CH1、VL-CLのN末をピンポイントで蛍光標識化することに成功した。今後、得られた各標識抗体を用いて、直接的手法によるアルテミシニンの検出が可能かどうか、詳細に検討する予定である。さらに、大量調製可能なインビトロ翻訳系を用いて、各Q-bodyの安定した調製法の確立についても、平行して進めて行く計画である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度は、新規にアルテミシニンを認識するモノクローナル抗体の作製ならびにQ-bodyの作製を重点的に行った。新規抗アルテミシニンモノクローナル抗体の作製については、現時点において既存の抗体以上の特性を有した抗体を得ることに成功していない。その理由として、ハプテンであるアルテミシニン誘導体がマウス体内において速やかに代謝を受けることで、その構造が変化するため、期待したアルテミシニンのみを認識する抗体が生産されないことを推定している。より、化学的に安定でアルテミシニン特有の構造を保持したハプテンの設計が必要と考えている。本申請課題の立案の段階で企図したハプテンに加え、新たな分子設計を計画し、以上の問題を解決したいと考えている。Q-bodyの作製については、得意とする抗体工学の手法を駆使し、順調に研究を遂行している。遺伝子の設計、増幅、各抗体断片の発現に成功した。既に、各抗体の調製法を確立し、その機能評価を行う段階にある。さらに一歩進んで、大量安価に調製する手法の確立も提案していきたいと考えている。今回の研究成果を基盤として、アルテミシニンのみならず様々な生理活性成分を対象とした分析へと展開したいと考えている。そのためには、効率的で、実用的な分析法であることを実証する必要があり、抗体の調製、機能評価についても、実験を繰り返し、その再現性を明確にする計画である。

Strategy for Future Research Activity

Quenchbody(Q-body)は直接的検出を可能とする抗体として、新規に開発された蛍光標識抗体である。既に、農薬やホルモンなどを測定対象とした迅速簡便なイムノアッセイに適用され、有用性が報告されている。一方、天然に存在する微量有効成分の検出に、Q-bodyを応用した成果はこれまで報告されておらず、今回の申請者の取り組みは、Q-bodyの応用範囲の拡大を目指した応用研究と言える。
今回、申請者が測定対象としているアルテミシニンはマラリアに対する第一選択薬であり、その生産は天然資源であるA. annuaからの抽出精製により賄われている。A. annua中のアルテミシニン含量はアルテミシニンの生産性向上に直結することから、アルテミシニン高含有品種の育種は有意義なテーマと言える。申請者が、開発を目指すQ-bodyを用いた迅速・簡便なイムノアッセイは、高価な機器を必要としない、迅速・簡便な手法と言え、様々な場面で有効に活用できると考えている。既に、アルテミシニンを認識する抗体ならびに組換え抗体を作出し、イムノアッセイを開発しているが、より選択的にアルテミシニンを定量分析できる高性能なモノクローナル抗体の調製を企図し、現在鋭意取り組んでいる。さらに、既に調製した抗アルテミシニン抗体も活用し、Q-bodyの調製も着実に進めている。今後も新規モノクローナル抗体の作製とQ-bodyの作製を同時に平行して進め、研究期間内に目的とするQ-bodyを用いたアルテミシニン迅速分析システムの構築を進めていく計画である。