2016 Fiscal Year Research-status Report
Project/Area Number |
16K08310
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Research Institution | Nigata University of Phermacy and Applied Life Sciences |
Principal Investigator |
渋谷 雅明 新潟薬科大学, 薬学部, 教授 (50170923)
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Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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Keywords | UDP-グルクロン酸 / UDP-グルコース脱水素酵素 / ダイズ |
Outline of Annual Research Achievements |
植物では、UDP-グルクロン酸は、UDP-グルコースがUDP-グルコース脱水素酵素により酸化を受け生産される。酵母にはUDP-グルクロン酸が存在しない。そのため、酵母内でUDP-グルクロン酸を生合成させる必要がある。平成28年度は、当初の計画どおりに、ダイズ由来UDP-グルコース脱水素酵素のクローニングを行い、酵母での発現、UDP-グルクロン酸の生産の確認を行った。 既知のダイズ由来UDP-グルコース脱水素酵素(Glyma08g26520)のN末、C末の配列に対応するオリゴDNAを合成し、ダイズのmRNAを鋳型にRT-PCRを行ったところ、1.4kbpの大きさのDNA断片が増幅された。このDNA断片を、2種の異なった遺伝子を発現させることができる市販の酵母発現ベクターpESC-URAに組み込み、複数個のクローンを得た。そのうち4種のクローンについてシークエンスを行い、PCRにより生じるエラーを含まないクローンを選択した。 得られたプラスミドを市販の酵母InvSc2に導入した。形質転換酵母を培養し、ガラクトースで発現を誘導後、培地をリン酸緩衝液に置換し、生成物を蓄積させた。酵母を収穫し、細胞を破砕後、生成物をブタノールで抽出した。ブタノールを除去し、残渣をメタノールに溶解した。得られたメタノール溶液を逆相HPLCで解析した。空ベクターで形質転換した酵母の抽出液ではUDP-グルコースに対応するピークが検出された。一方、ダイズ由来UDP-グルコース脱水素酵素遺伝子を組み込んだプラスミドで形質転換した酵母の抽出液ではUDP-グルコースに対応するピークの強度が減少し、新たに、UDP-グルクロン酸に対応するピークが検出された。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実績概要で述べたように、初年度は、ダイズ由来UDP-グルコース脱水素酵素のクローニング、酵母での発現、UDP-グルクロン酸の生産の確認を計画しており、予定どおりの成果を得たと判断できる。
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Strategy for Future Research Activity |
ソヤサポゲノールB - UDP-グルクロン酸転移酵素は、これまでクローニングされていない。ダイズの全ゲノム配列のデータベースから、配糖化酵素とアノテーションが付いているものを全てリストアップし、mRNAの発現パターンとソヤサポニンの生産の相関を詳細に検討し、候補遺伝子を絞り込む。 前年度に使用したpESC-URAは、2種の異なった遺伝子を発現させることができる酵母発現ベクターである。平成29年度は前年度に得られたプラスミドのもう一つのクローニングサイトに上記候補遺伝子を組み込み、酵母で発現させソヤサポニンの生産を調べることによりソヤサポゲノールB - UDP-グルクロン酸転移酵素の同定を行う。
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