2016 Fiscal Year Research-status Report
細菌型チロシンキナーゼを標的とした革新的抗菌薬の開発研究
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16K08341
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
深澤 秀輔 国立感染症研究所, 真菌部, 室長 (10218878)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 細菌型チロシンキナーゼ / スクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年ほとんどの抗生物質が効かない多剤耐性菌が出現、大きな問題となっている。細菌のチロシンキナーゼは、真核生物のものと類似性がなく、構造が全く異なるため、その阻害剤は細菌のみに作用する選択性が期待できる。しかし活性の検出方法、評価系がまだ確立されておらず、BY-kinaseの阻害物質はまだ知られていない。本研究では細菌型チロシンキナーゼ阻害物質の評価系を構築し、スクリーニングを行い、細菌型チロシンキナーゼ阻害剤の抗菌薬、抗結核薬としての可能性を追求する。
黄色ブドウ球菌のチロシンキナーゼの触媒サブユニットのCapB2と調節サブユニットのCapA1をクローニングし、CapB2の全長とCapA1の活性化領域を融合させたCapA1B2プラスミドを作製した。CapA1B2のN末にさらにタグを付加してHEK293T細胞に発現させ、cell-based ELISA系を構築した。所有する化合物ライブラリーに阻害物質を探索し、約200化合物を評価した。多くの保存された部位の変異体を作製し、キナーゼ活性に必要なアミノ酸残基や領域を特定することができた。
CapB2とCapA1、それぞれの全長をHEK293T細胞に発現させたところ、単独発現ではCapA1は細胞膜、CapB2は細胞質に局在した。共発現させるとCapB2は膜に移行、CapA1と局在が一致し、CapB2がCapA1と相互作用することが確認できた。CapA1とCapB2それぞれの欠失体を多数作製し、相互作用に関わるN末端およびC末端の領域を特定した。またCapB2はCapA1類縁のCapA2とも結合すること、キナーゼ活性が確認されないCapB1はCapA1ともCapA2とも相互作用しないことがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
スクリーニングは強力な阻害物質は得られなかったものの、順調に進捗した。CapA1の活性化領域とCapB2の融合ではなく、それぞれの全長を発現させ、CapB1の細胞内局在の変化を観察することにより、CapA1とCapB2の相互作用を解析できるようになったことは収穫であった。CapA1のC末端細胞質領域を欠失させるとCapB2の膜移行は観察されず、この部位がCapB2と結合することが示された。またCapB2変異体を多数作製し、CapA1結合能とキナーゼ活性の関連を調べたところ、CapB2キナーゼ活性にはCapA1との相互作用が必須であることが判明した。また類縁のCapB1はCapA1とは結合せず、それがCapB1にキナーゼ活性が観察されない理由の一つであると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き黄色ブドウ球菌チロシンキナーゼ阻害物質のスクリーニングと阻害物質物質の作用解析を行う。CapB2のキナーゼ活性にはCapA2との結合が必要であったことから、結合に関与する部位が阻害剤のリードとなる可能性があるので、CapA1とCapB2の相互作用の解析をさらに進める。他のグラム陽性菌の細菌型チロシンキナーゼや、グラム陰性菌の細菌型チロシンキナーゼ（同一タンパク質内にキナーゼ領域と活性調節領域が存在する）、さらにはこれらいわゆるBY-kinaseファミリーとは相同性のない結核菌等のチロシンキナーゼをクローニングし、黄色ブドウ球菌CapB2と同様、HEK293T細胞での活性発現の検討を行う。
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| Causes of Carryover |
実験機器、試薬が当初の見込みより安く購入できた。また発売時期等の関係から、一部機器の購入を延期した。決済が当該年度中に行われなかった支出があった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
価格変動に応じて物品の購入を調整する。昨年度延期した機器購入を行う。
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