2018 Fiscal Year Research-status Report
細菌型チロシンキナーゼを標的とした革新的抗菌薬の開発研究
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16K08341
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
深澤 秀輔 国立感染症研究所, 真菌部, 室長 (10218878)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 細菌型チロシンキナーゼ / スクリーニング / タンパク質間相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌には、真核生物のものと類似性がなく、構造が全く異なるチロシンキナーゼが存在する。細菌型チロシンキナーゼの性質を調べるため、黄色ブドウ球菌チロシンキナーゼ触媒サブユニットCapB2と調節サブユニットCapA1に種々のタグを付加し、HEK293T細胞に発現させた。CapB2に対する抗体を作製し、25種類以上のタグを試したところ、細菌型チロシンキナーゼはN末に蛍光タンパクを付加させた場合にのみ、動物細胞で発現することがわかった。単独発現ではCapA1は細胞膜、CapB2は細胞質に局在した。共発現させるとCapB2は細胞質から膜に移行、CapA1と局在が一致し、CapB2とCapA1の相互作用を可視化することができた。また相互作用により、CapB2のチロシンキナーゼ活性は亢進した。CapA1全長ではなくC末の細胞質領域のみでも、CapB2との相互作用が観察された。CapA1活性化領域に四量体を形成する蛍光タンパクタグ、CapB2に単量体蛍光タンパクタグを付加して共発現させるとCapB2のリン酸化は著しく上昇した。リン酸化部位については、様々な状況証拠からタグ部分であると推測されていたが、実際に蛍光タンパクタグがチロシンリン酸化されることを確認した。また同時にCapB2のC末チロシンクラスターが自己リン酸化されることも明らかとなった。チロシンクラスターは変異、欠失させてもタグ部分のリン酸化は検出されることから、キナーゼ活性には自己リン酸化は必要ないことが判明した。CapA1のC末からアミノ酸6残基を欠失させるとCapB2と相互作用しなくなり、ここが結合部位の一部であると推定された。また類縁のCapB1はCapB2と70%以上の相同性があるにもかかわらず、不活性であると報告されてきたが、127番目のバリンがCapAとの相互作用とキナーゼ活性に大きく影響していることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細菌型チロシンキナーゼ阻害物質のスクリーニングは予定通り進捗し、活性物質がいくつか見いだされている。黄色ブドウ球菌チロシンキナーゼCapB2が、付加した蛍光タンパクタグをチロシンリン酸化することを証明した。蛍光タンパクがチロシンキナーゼの基質になる例は我々の知る限りなく、細菌型チロシンキナーゼは周囲の配列に依存しない基質特異性の低いチロシンキナーゼであると思われる。またHEK293T細胞内でCapB2のC末チロシンクラスターが実際に自己リン酸化されることも示した。触媒サブユニットと調節サブユニットの相互作用が可視化できるようになったことで、活性化機構の解析は進んだ。今までCapB1がなぜキナーゼとして不活性であるかは不明であったが、その理由の一部が127番目のバリンにあることが明らかとなった。127番目のアミノ酸近辺の領域は、グラム陰性菌のものも含め、細菌型チロシンキナーゼ間でよく保存されており、Walker domains、C末チロシンクラスターに加え、細菌型チロシンキナーゼのsignature motifと見なしてもよいと考えられる。現在CapB1とCapB2の様々なキメラを作製し、活性化機構をより詳しく解析している。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き黄色ブドウ球菌チロシンキナーゼ阻害物質のスクリーニングを行う。黄色ブドウ球菌以外のチロシンキナーゼの活性も検出可能となっているので、菌によって阻害剤感受性に違いがあるかどうかを調べる。異なる菌由来の触媒サブユニットと調節サブユニットをHEK293T細胞で共発現させると、相互作用、キナーゼ活性化が起きる場合と起きない場合がある。細菌型チロシンキナーゼの活性化について、種々の菌に共通する機構、個々のキナーゼに特有の機構、グラム陽性菌とグラム陰性菌の相違点等を調べる。また黄色ブドウ球菌チロシンキナーゼとは相同性のない結核菌のチロシンキナーゼ、また結核菌チロシンホスファターゼをクローニングしたので、HEK293T細胞での活性発現の検討を行う。また、本研究で開発した手法を、一般的なタンパク質間相互作用の解析へ応用することを目指す。
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| Causes of Carryover |
研究成果の論文投稿、追加実験を行うため、補助事業期間を延長した。
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