2017 Fiscal Year Research-status Report
ウイルス感染病態の進行におけるヘパラン硫酸とヘパラナーゼ
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16K08342
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| Research Institution | Hoshi University |
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Principal Investigator |
東 伸昭 星薬科大学, 薬学部, 教授 (40302616)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安達 勇光 公益財団法人微生物化学研究会, その他, 研究員 (00250051)
山本 典生 順天堂大学, 医学部, 准教授 (40323703)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 微生物・感染症学 / インフルエンザウイルス / 上皮細胞 / ヘパラナーゼ / 組織修復 / プロテオグリカン / マスト細胞 / 炎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題の目的は、「ウイルス感染機構と、その後に生じる上皮組織の障害機構を解明し、これを阻害する薬理学的手法を見出す」ことである。平成29年度はインフルエンザウイルス感染において感染調節を行うヘパラン硫酸のコアタンパク質の同定を目指した。また、組織修復の場におけるヘパラナーゼの発現調節機構と活性抑制がもたらす影響について検討した。
平成28年度の実績を受け、硫酸化糖鎖の提示に関わるコアタンパク質の同定を目指した。mRNAの発現解析の結果、肺上皮細胞におけるシンデカン-1、-2、-4の発現を認めた。このうち、シンデカン-1、-2を欠損する細胞の構築を試みた。研究分担者・山本博士と共同して、crispr-Cas9による遺伝子ノックアウト細胞を得るためのベクターの構築に成功し、ヒト肺上皮細胞株A549へのベクター導入を完了した（発現欠損クローンの取得は平成30年度に計画中）。
研究分担者・安達博士と共同して、肺組織の組織修復におけるヘパラナーゼの関与を検討した。上皮細胞の増殖がヘパラナーゼ阻害剤の添加によって抑制されることを平成28年度に見出した。これは細胞周期制御タンパク質の発現上昇を介する現象であることを新たに示した。一方、肺組織に存在し、ヘパラナーゼを阻害する内在性物質の同定に新たに成功した。生体内で組織修復に関わるマスト細胞はヘパラナーゼを発現するが、これに対し、in vitroで培養した骨髄由来マスト細胞では、分泌顆粒内のヘパラナーゼ発現は検出されなかった。これらの事実からマスト細胞が細胞外のヘパラナーゼを取り込んで分泌顆粒内に再構成する機構を想定し、取り込み過程における硫酸化糖鎖の切断の有無が取り込みのオンオフを制御していることをヘパラナーゼ阻害剤を用いた細胞試験により示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の遂行において、上皮細胞へのウイルス感染に関わる分子を明確に同定するには、該当遺伝子を欠損する「ノックアウト」細胞の構築が不可欠であると考えられた。研究分担者・山本博士との共同でこの点が解決されつつある。肺上皮細胞A549に対する遺伝子導入について、山本博士には長年のノウハウがあり、この技術と星薬大での発現解析法とを組み合わせることで、ノックアウト細胞の構築まであとわずかのところにこぎつけた。
研究分担者・安達博士との共同で、組織修復に関与するヘパラナーゼについて、上皮細胞への作用、組織に分布するマスト細胞における発現調節の両面から検討を行った。安達博士によって合成されたヘパラナーゼ阻害物質を活用することにより、上皮細胞の増殖調節におけるヘパラナーゼの関与、またヘパラナーゼのマスト細胞への取り込み機構、の両者について新たな知見を示すことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
前半の「ウイルスの上皮細胞感染におけるヘパラン硫酸の関与」については、平成30年中に間も無く得られる予定のノックアウト細胞を用いることで、どのコアタンパク質の提示する硫酸化糖鎖が感染の成立に関与するかを明確にする。
後半の「組織修復におけるヘパラナーゼの関与」について、平成30年度中にヘパラナーゼの発現を欠損するノックアウト細胞を確立する予定である。この細胞とヘパラナーゼ阻害剤を用いて、組織修復時の細胞増殖をヘパラナーゼが制御する機構を細胞周期制御の立場から解明する。マスト細胞へのヘパラナーゼ取り込みについては、「活性を持たないヘパラナーゼ変異体」を準備している。変異体タンパク質を用いることにより硫酸化糖鎖の切断が取り込みのオンオフを制御する可能性を検証する。さらにインフルエンザウイルス感染時の組織修復におけるヘパラナーゼの関与について個体レベルの検討を行う。実験に用いるためのヘパラナーゼ阻害剤の合成は既に研究分担者・安達博士によって完了しており、研究分担者・山本博士を中心に実施予定である。併せてヘパラナーゼの内在性阻害物質の病態の場における発現変化を研究代表者を中心に検討する。
本研究課題が開始された後、平成28年になって、ヘパラナーゼの発現が細胞側が易感染状態に移行するためのスイッチとして機能するという報告が他の研究者からなされた。インフルエンザウイルスについても、ヘパラナーゼが易感染状態を誘導するスイッチとして機能するのか、確立したツールを活用して検討を進めたい。
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| Causes of Carryover |
（理由）
研究代表者が現所属の星薬科大学に異動し、平成29年度前半は研究室に新規配属された学生15名の卒論研究の指導を本務として注力しつつ、本科研費の研究課題の遂行に取り組んだ。本課題を担当する学生が別々の学年に所属しており、学年をまたいだ学生間の協力体制の構築に時間を要した。後期からは学生間の連携が進んでいる。
（使用計画）
平成30年度であるが、研究全体の中で鍵となっているノックアウト細胞の確立とその評価に注力し、ヘパラン硫酸コアタンパク質・ヘパラナーゼの欠損時におけるインフルエンザウイルスの感染効率と修復への影響を検討する。またインフルエンザウイルス感染の疾患モデル系を利用した解析についても引き続き準備を進める。これらについて平成30年度に繰り越された研究費を活用したい。
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Research Products
(8 results)
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[Journal Article] Microbial metabolites and derivatives targeted at inflammation and bone diseases therapy: chemistry, biological activity and pharmacology.2018
Author(s)
Adachi H, Nakae K, Sakamoto S, Nosaka C, Atsumi S, Shibuya M, Higashi N, Nakajima M, Irimura T, Nishimura Y.
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Journal Title
J Antibiot (Tokyo).
Volume: 71
Pages: 60-71
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] A humanized mouse model identifies key amino acids for low immunogenicity of H7N9 vaccines.2017
Author(s)
Wada Y, Nithichanon A, Nobusawa E, Moise L, Martin WD, Yamamoto N, Terahara K, Hagiwara H, Odagiri T, Tashiro M, Lertmemongkolchai G, Takeyama H, Groot AS, Ato M, Takahashi Y.
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Journal Title
Scientific Reports.
Volume: 7
Pages: 1283
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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