2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K08348
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| Research Institution | Teikyo Heisei University |
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Principal Investigator |
小川 裕子 帝京平成大学, 薬学部, 准教授 (30267330)
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| Project Period (FY) |
2016-10-21 – 2019-03-31
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| Keywords | exosome / 粘膜免疫 / マクロファージ / 唾液 / LPS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト全唾液（WS）由来粘膜免疫エキソソーム（Exo）のマクロファージ（Mφ）への作用に関与しうるExo表面分子のうち、LPS、分泌型IgA（sIgA）のExoへの結合状態およびMφへの作用の精査を行った。Exoの精製では、限外濃縮による低分子除去後にゲルろ過クロマトグラフィーを行う。そこで各段階のLPSおよびsIgAを定量した。LPSは限外濃縮の通過画分からWSの6割が検出されたが、ゲルろ過クロマトグラフィー後にも約2割がExo画分から検出された。一方、sIgAはゲルろ過後のExo画分よりも低分子側に大部分が検出された。Exoのリクロマトグラフィーを行うとさらにExo画分と低分子画分に分けられ、LPSはExo画分から検出された。プロテオーム解析により、低分子画分からは主にsIgAを検出した。以上のことからLPSおよびsIgAはExoと緩く相互作用しており、一部はExoに強固に結合していると考えられた。
WSおよびExoをLPS濃度を合わせてMφに添加するとNO産生はWS≧Exo≒LPS標準品であるが、リクロマト後のExo画分はWSに近いNOを産生した。この結果はポリミキシンB結合レジンによりLPSを除去したExoと同様であった。以上のことから、Exoは平常時に口腔内のLPSを吸着して過剰なNO産生を抑制し、口腔内での細菌感染時などに、LPSおよびインターフェロン-γなどのサイトカイン濃度の上昇に伴ってNO産生を増強し、殺菌作用を示すことが考えられた。さらに、Exo本体にNO産生を増強する因子が存在することも示唆された。
Exoの体内動態を調べるために消化液による影響を精査した。胃内条件あるいは腸内条件下では一部のExo表面タンパク質が分解されるものの内部のタンパク質は保たれ、形態も維持されていたので、少なくともExoの一部は胃を通過して腸内に達する可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はExoによるNO産生制御に関与する因子、特にLPSを抑制する因子の同定を行う予定としていた。DPP IVはII型膜タンパク質としてExo本体に強く結合しているが、分泌タンパク質であるsIgAおよびmucin 5B、口腔内に存在するLPSはExoと緩く相互作用していることをリクロマトグラフィーにより確認した。また、クロマトグラフィー後の各画分のプロテオーム解析により、低分子の分泌タンパク質でありながら、Exoのリクロマト後もre-Exo画分に存在するCAP-18のような低分子も見いだした。さらにリクロマトグラフィー後のExoはMφからのNO産生能が増強されることも見いだした。以上のことからLPS抑制の候補分子を見いだしただけでなく、NO産生に関与する分子の存在も示唆された。実験手法については、Exoと複合体を形成することで特有の生理作用を持つタンパク質の同定が可能になると共に、Exoとの結合状態を解析する基盤が構築できた。今後は候補分子を精査し、MφからのNO産生を抑制、増強する分子の同定が可能と考えられる。本同定により、粘膜免疫Exoが口腔内の感染性物質などによるMφ活性化を制御する機構が明らかになる可能性がある。
Exoの体内動態については、ペプシン、パンクレアチン、デオキシコール酸Naを用いて消化液による影響を精査し、胃内条件および腸内条件での通過時間経過後に少なくとも一部のExoは胃を通過して腸内に達する可能性があることを見いだした。この条件を利用して蛍光標識Exo（調製方法は構築済）を用い、実験動物での体内動態の検討は順調に進行すると考えられる。Exoの体内動態およびMφに対する作用を明らかにすることで、Exoの体内における新たな機能を解明できる可能性がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
粘膜免疫ExoのMφによる活性化制御に関わる候補分子の精査を行う。Exoおよびその表面分子のプロテオーム解析データより、①Exo表面に存在するMφからのNO産生を抑制する分子、②Exo本体に結合しNO産生を増強する分子を候補分子として抽出し、Mφに対する作用を明らかにする。具体的には候補分子を単独あるいはExoと共にMφに添加しNO産生を比較することで、これら分子の関与を検討する。この際、MφからのNO産生に関わるIFN-γ等のサイトカインの産生量をELISA等で検討し、Exoにより炎症に関連するサイトカインが産生されるかも検討する。NO産生が変化した分子に関しては、阻害剤および中和抗体による影響を、その分子単独とExoとで比較し、複合体として作用に変化があるかを検討する。NO産生に関わることを確認した分子については、本年度構築した方法を用いてWSからExoIIへの精製過程での挙動を調べる。これまでにリクロマトグラフィーによるExoへの結合状態検討の条件を決定し、ELISAの系を構築したので、候補分子の追跡および定量の準備が整った。従って、検討は効率的に行えると考えられる。
体内動態に関しては3種類の消化液（ペプシン、パンクレアチン、デオキシコール酸Na）について、Exoの形態が維持される濃度を決定したので、実際に体内で維持されるかを蛍光標識Exoを用いてマウスで検討する。各臓器での蛍光分布の経時変化を明らかにするとともに、蛍光標識Exoを回収し、構成成分のプロテオーム解析およびMφへの効果を上記の方法で検討する。これにより粘膜免疫Exoの機能解析が完了すると考えている。
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Research Products
(6 results)
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[Presentation] ERAP1結合型エキソソームによるマクロファージの古典的活性化2017
Author(s)
後藤 芳邦, 小川 裕子, 津元 裕樹, 三浦 ゆり, 中村 孝博, 小川 健司, 服部 明, 秋元 義弘, 川上 速人 , 遠藤 玉夫 , 矢ノ下 良平, 辻本 雅文
Organizer
2017年度生命科学系学会合同年次大会
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