2016 Fiscal Year Research-status Report
化学物質の代謝活性化を基盤とした皮膚免疫毒性物質探索システムの開発
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16K08353
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| Research Institution | Azabu University |
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Principal Investigator |
関本 征史 麻布大学, 生命・環境科学部, 准教授 (10381732)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 接触性皮膚炎 / 代謝活性化 / サイトカイン / P450 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成28年度は、代表的な免疫毒性化学物質を用いて、それらの異物代謝酵素誘導や、あるいは代謝酵素添加系における活性化に伴った免疫細胞活性化の関連性を、免疫モデル細胞を用いて解析することを目指した。
まず、免疫毒性評価に繁用されるヒトTHP-1細胞、K562細胞に対して、代表的な接触性皮膚炎誘発物質として硫酸ニッケル、2,4-ジニトロクロロベンゼン （DNCB）を、免疫活性化剤としてリポ多糖（LPS）を、また、異物代謝活性化酵素（CYP1A酵素）誘導能を持ち、自身も代謝活性化を受ける3-メチルコランスレン（MC）を処理し、各細胞における異物代謝酵素およびサイトカイン（IL-1α/β、IL6、IL-8、TNF-α、IFN-γなど）の遺伝子発現変動をリアルタイムRT-PCR法により、また、THP-1細胞での表面抗原マーカー（CD54、CD86）の発現変化をフローサイトメトリーにより解析した。その結果、LPS処理では顕著なサイトカイン遺伝子発現変動が、また、硫酸ニッケル、DNCB処理では表面抗原マーカーの発現変動がそれぞれ確認されたが、MCによる誘導はほとんど見られなかった。MCによるCYP1A1の誘導もみられなかったことから、THP-1細胞では代謝酵素の誘導能・機能がともに欠失しており、免疫毒性発現に代謝活性化を必要とする化学物質を直接評価することは困難であることと考えられた。
そこで、異物代謝酵素の外部添加による影響の解析を目指した。まず、ヒトCYP1A2発現酵母抽出物を用いて予備検討を行ったが、期待すべき酵素活性を得ることが出来ず、その使用を断念した。そこで、実験動物（ラット）に対して様々な酵素誘導剤を投与し、S9の調製を行った。このS9の共存下、免疫毒性発現に代謝活性化を必要とする化学物質の毒性がどのように変化するか、解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成28年度に予定していた、「既存免疫毒性化学物質曝露による異物代謝酵素誘導と免疫細胞活性化の関連性解析」については、一部を除き順調に進行している。フローサイトメーターによる解析については、条件検討に時間を要したこと、また、機器の利用が混み合っていることなどの理由で、まだ十分な解析が行えていない。
また同年度に予定していた、「異物代謝酵素の外部添加による影響の解析」については、本年度の予定に大幅な遅れが生じた。使用を予定していたヒトP450分子種発現酵母抽出物は、購入して予備検討した結果、本実験系には適さないことが判明したため、ラットS9を作成し利用することとした。しかし、本学において申請者が動物実験を行っておらず、動物実験の許可申請に時間を取られたことが遅れの大きな要因となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度はまず、ヒト白血病細胞株（THP-1など）に対し種々の代謝活性化酵素（ラットS9）の存在下、前駆型毒性物質を処理し、各細胞の活性化状態をサイトカイン（IL-1α/β、IL6、IL-8、TNF-α、IFN-γなど）遺伝子発現変動、表面抗原マーカー（CD54、CD86）の発現を指標として解析する。また、遺伝子発現、表面抗原発現とは異なった方法で免疫毒性を評価するために、NF-kB、AP-1、Nrf2などの関連転写因子、あるいはIL-8遺伝子プロモーターの活性化を評価できるレポーター細胞を構築し、これを用いた評価啓の構築を進める。
さらに、１）免疫毒性物質の代謝活性化に関わることが想定されるヒトCYP分子種の発現プラスミドを別途作成し、これをヒト白血病細胞株に導入することで、２）ヒトCYP分子種を発現している細胞株（HepG2、A549など）と白血病細胞株を共培養すること、などにより、S9非存在下でも前駆型毒性物質による免疫毒性の評価が可能かについても検討を進める。
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| Causes of Carryover |
日本薬学会137年会が年度末（3/25~27）に開催されたため、事務手続き上、次年度の予算による執行とした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
新年度に入り、日本薬学会による出張経費として直ちに執行した。
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