2017 Fiscal Year Research-status Report
薬剤性肺線維症の分子メカニズムの解明とゲノム薬理学的解析の統合的研究
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16K08401
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
山本 和宏 神戸大学, 医学部附属病院, 薬剤師 (30610349)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 間質性肺疾患 / mTOR阻害薬 / 上皮間葉転換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
mTOR阻害薬エベロリムス(EV)による間質性肺疾患発症メカニズムの分子生物学的解明を目的とし、組織線維化の代表的なメカニズムである上皮間葉転換(EMT)に着目し、EVを長期曝露したヒト肺胞上皮細胞（A549/EV細胞）のプロファイル解析を行った。A549/EV細胞のmRNAを抽出し、マイクロアレイ解析により網羅的な遺伝子発現解析を行った結果、元細胞と比較して、A549/EV細胞に発現の変化を示した複数の遺伝子を特定した。特に顕著な変動を示した遺伝子について、SYBER Green法によるmRNA発現量の解析を行い、マイクロアレイの結果を個別に検証した。mRNAの発現変動が確認された遺伝子については、コードするタンパク質の発現解析をwestern blot法により行い、タンパク質レベルでの発現変動が生じていることを確認した。発現変動を確認できたタンパク質はcarboxylesterase 1 (CES1)、aldo/keto reductase 1C1 (AKR1C1)、fibronectin (FN)などである。
A549およびA549/EV細胞の培養上清を回収し、培地中のケモカインをBio-plex法により半網羅的に解析した。解析した12種のケモカインのうち、C-X-C motif chemokine ligand (CXCL) 2、CXCL5、Interleukine-8およびC-C motif chemokine ligand (CCL) 15について、A549細胞とA549/EV細胞の培地中濃度に有意な差を認めた。特に、CXCL5およびCCL15の培地中濃度は、長期曝露による変化量が大きかった。
今後、これらの特定した変動因子の機能解析を行い、EVの誘導するEMTにおける寄与を評価する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、基礎的検討については、メカニズムの標的を文献的考察よりある程度限定して進める予定であった。しかし、この方法では得られる情報も限定的であり、潜在的なメカニズムを見逃すリスクが高い。そこで、外部委託により実施可能な網羅的遺伝子解析および網羅的ケモカイン解析を組み合わせて行うこととし、この検討が、極めて膨大な情報量を短時間で比較的安価に入手することを可能とした。これらの情報整理についても初期より専門家のアドバイスを受けながら実施することで、停滞することなくデータを蓄積することができたと考える。また、網羅的な解析により特定された変動因子が膨大な数ではなかったことから、その後の個別の発現解析についても障害なく進めることができた。一方、網羅的な解析の実施が遅かったことから、機能的解析を完遂できておらず、発現変動を示した因子の線維化に対するそれぞれの寄与を明らかにすることができていない。これらを次年度以降に急速に進める必要がある。
臨床研究については、途中より単施設研究から多施設共同研究に変更したことにより、登録患者が急激に増加した。間も無く予定症例数に到達するため、登録期間を終了し、検体の解析と臨床データの入手を進めている。他施設からの検体受け入れや臨床データも停滞することなく入手できた。当初の計画では、臨床研究の対象は、EGFR阻害薬の投与経験を有する肺がん患者なども含めた幅広い計画としていたが、多施設共同研究に変更したことにより、実施可能性を最大限に考慮し、mTOR阻害薬の投与経験を有する腎細胞がん患者のみとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
基礎研究については、網羅的解析により特定した変動因子の機能解析を行う。機能解析についてはこれまでの外部委託による実験の推進が困難であるため、部内スタッフを従事させるための育成から取り掛かる必要がある。必要に応じて企業の主催する技能研修やワークショップ等に参加させ、当分野にない技能の習得を行うこともある。基本的な技能についてはこれまで標準化した実験プロトコールを活用することで対応することが可能であるが、残りの研究期間も鑑み、自施設のみでの実施が困難である場合には他施設との共同研究とすることも考慮する。また、外部業者での実験委託についても考慮する。これまでの進捗状況を考慮しても、残りの研究期間での完遂が十分可能であると想定している。
臨床研究については、多施設共同研究により他施設の試料およびデータをすでに回収しており、随時、SNP解析を進めている。登録した患者の解析はほぼ完了しているため、今後の進行に障壁はないと考える。臨床データについても十分に吟味された症例報告書の雛形を作成しており、それらが他施設でも使用されているため、データの加工・整理についても多大な労力を必要としない。自身のエフォートが十分に確保できない場合、データ解析を部内スタッフに従事させることを検討する。部内には臨床薬理に関するデータマネージメントの資格を有する者や医学統計に精通する者が複数在籍しており、研究成果における質は十分に担保されるものと考える。
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| Causes of Carryover |
（次年度使用金が生じた理由）
当初の計画では、薬剤をEGFR阻害薬も含めた幅広い分子標的治療薬を対象に含めていたが、実験の進捗を鑑み、mTOR阻害薬のみを対象とすることとした。また、2017年度に実施したマイクロアレイ解析およびケモカイン解析による網羅的変動因子の探索により膨大な情報を入手することができたため、当初の予定であった標的志向型の研究よりも結果的には費用を抑えることができた。さらに、これらの解析は外部委託であり、費用は変動するが、キャンペーン等のタイミングも重なり、全体として非常に安価に解析を完遂することができた。さらに、共通使用が可能な実験器具を科研費以外で調達する機会もあったことが影響している。これらの予算は科研費申請時には予定しておらず、実験器具として調達が不要となったことが余剰を発生させた要因の一つである。
（使用計画）
2018年度は最終年度であり、基礎研究の深化と臨床研究データの整理が主たる実施項目である。基礎研究については、部内スタッフの技術向上のための研修会参加やワーウショップなどの参加費用にも充当することを考慮する。基礎研究は少数スタッフにより実施するため、業務効率化のための委託費や器具類を充実させることも検討する。臨床研究についてはデータの整理のみであり、消耗品や旅費にかかる費用は見込まない。
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[Presentation] Molecular cornifying mechanisms of multi-targeted tyrosine kinase inhibitors-induced hand-foot skin reaction based on genetic differences of STAT32017
Author(s)
Kazuhiro Yamamoto, Takahiro Ishida, Tsutomu Nakagawa, Tatsuya Nishioka, Manabu Kume, Hiroo Makimoto, Hideaki Miyake, Masato Fujisawa, Chikako Nishigori, Ikuko Yano, Midori Hirai
Organizer
The 15th International Congress of Therapeutic Drug Monitoring & Clinical Toxicology (IATDMCT 2017)
Int'l Joint Research
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