2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K08412
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
川野 雅章 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (30447528)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | polyomavirus / simian virus 40 / major capsid protein / VP1 / virus-like particle / mucosal immunology / mucosal adjuvant / immune induction agent |
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| Outline of Annual Research Achievements |
サルのポリオーマウイルスであるsimian virus 40 (SV40) はVP1のみで直径45 nmの正二十面体構造のウイルス粒子を構築することができる。VP1は昆虫細胞にバキュロウイルスを用いて発現させるとその自己集合化能によってウイルス様粒子 (virus-like particle: VLP) を構築するので、大量に発現させることでSV40 VLPを精製することができる。これまでの我々の解析でこのVLP内部に抗原を内包し、マウスに免疫することで経鼻投与によっても内包抗原に対し高度に獲得免疫を誘導できることが明らかになっている。しかしながら、SV40 VLPによる獲得免疫誘導機構は不明である。仮説としてSV40 VLPの細胞表面受容体であるガングリオシドGM1に結合した後、獲得免疫を誘導する因子を刺激して免疫活性化シグナルを活性化しているものと考えられる。本研究で我々は新たに鼻咽頭関連リンパ組織において抗GM1抗体が特異的に結合することを発見した。このことから鼻咽頭関連リンパ組織にはGM1が発現していると想定される。また、SV40 VLPが作用する免疫活性化シグナル伝達の最上流因子を解析するために、SV40 VLPを蛍光標識したのちタンパク質マイクロアレイを利用して、VLPと相互作用する因子の網羅的な解析を行った。その結果、SV40 VLPの細胞内侵入経路に存在し、VLPと高度に結合する膜タンパク質の候補を2つ同定することに成功した。加えて、ex vivoでVLPと粘膜免疫細胞をインキュベーションし、その粘膜免疫細胞をマウスに移植することで、VLPに対する獲得免疫応答を誘導する系を構築するために、まず指標としてex vivoでVLPと脾臓リンパ球をインキュベーションし、その脾臓リンパ球をマウスに移植することでVLPに対する獲得免疫応答を誘導する系の構築を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究計画年度においては、SV40 VLPの受容体であるGM1のマウス鼻咽頭関連リンパ組織における発現解析、および、SV40 VLPによる免疫活性化シグナル伝達経路の解析を予定した。実際、マウス鼻咽頭関連リンパ組織におけるGM1の発現を確認するために、GM1を蛍光抗体で標識し、FACSで解析を行った。その結果、GM1特異的な蛍光シフトが観察されたことから、マウス鼻咽頭関連リンパ組織にもGM1が発現していることが示唆された。また、SV40 VLPによる免疫活性化シグナル伝達経路を解明するため、シグナル伝達の最上流に位置すると考えられる、SV40 VLPの細胞内侵入経路に存在するタンパク質で、SV40 VLPと相互作用するタンパク質の網羅的解析を行った。その結果、SV40 VLPと相互作用する細胞内侵入経路に存在するタンパク質として、ハウスキーピング遺伝子に属するタンパク質を1つと、免疫細胞で高度に発現し、炎症性の病気に関連のあることが示唆されるタンパク質を1つ同定した。加えて、マウス鼻腔に移植することで、獲得免疫応答を誘導する解析を行うために、まずex vivoでVLPと脾臓リンパ球をインキュベーションし、その脾臓リンパ球をマウスに移植することでVLPに対する獲得免疫応答を誘導する系の構築し、獲得免疫応答を誘導するための条件を検討した。また、高病原性・難治性ウイルスに対するワクチン、および、がんワクチンの効能を解析するための抗原内包VLPを調製するための遺伝子コンストラクトを構築した。これらのことから、SV40 VLPによる獲得免疫誘導機構の解析のための系の構築、SV40 VLPによる免疫活性化機構の解明のための免疫活性化因子の同定、および、SV40 VLPと相互作用する細胞表面因子の同定が進んでいるため、全体として研究計画はおおむね順調に進んでいると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度の研究計画年度における研究の推進方策は、平成29年度の研究計画の遂行により、SV40 VLPの細胞内侵入経路において相互作用する因子を同定したので、その因子とSV40 VLPとの詳細な相互作用解析を行う。また、SV40 VLPの免疫活性化におけるシグナル伝達における同定した因子の関与を解析する。これらの解析結果を基に、SV40 VLPによる粘膜免疫の活性化における同定した因子の関与を解析する。加えて、平成29年度の研究計画においては、マウス鼻腔に移植することで、抗体産生や細胞傷害性T細胞の誘導解析を行うために、まずex vivoでSV40 VLPと脾臓リンパ球をインキュベーションし、その脾臓リンパ球をマウスに移植することでSV40 VLPに対する獲得免疫応答を誘導する系の構築を行った。この系を用いて、平成30年度研究計画においては、SV40 VLPに対する獲得免疫応答を誘導するために必要な細胞集団、細胞性因子の解析を行う。また、この結果を基に、ex vivoでSV40 VLPと脾臓リンパ球をインキュベーションし、その脾臓リンパ球を経鼻移植することでSV40 VLPに対する獲得免疫応答の誘導を試み、経鼻移植において獲得免疫応答の誘導に必要な細胞集団、細胞性因子の解析を行う。さらにこの結果を基にして、ex vivoでSV40 VLPとマウス鼻咽頭関連リンパ組織をインキュベーションし、そのマウス鼻咽頭関連リンパ組織をマウスに経鼻移植してSV40 VLPに対する獲得免疫応答の誘導を試み、マウス鼻咽頭関連リンパ組織中の免疫応答の誘導に必要な細胞集団、細胞性因子の解析を行う。加えて平成30年度の研究計画年度では高病原性・難治性ウイルスに対するワクチン、および、がんワクチンの効能を解析するための抗原内包VLPを調製し、抗原に対する獲得免疫応答の誘導、および、効能を評価する。
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| Causes of Carryover |
平成29年度研究計画においては、SV40 VLPの細胞表面受容体であるガングリオシドGM1の下流のSV40 VLPによる免疫活性化のシグナル伝達経路の解析を行った。この解析を行うため、様々な免疫細胞集団をマウス脾臓細胞より単離し、また、ウス鼻咽頭関連リンパ組織を単離して、種々のシグナル伝達阻害剤を用いてSV40 VLPによる免疫活性化に伴い上昇する免疫活性化マーカー、サイトカイン、ケモカインの発現・分泌を解析した。これらの解析を遂行するにあたり、解析試薬の購入頻度が若干少なかったため、次年度使用額が生じた。生じた次年度使用額は、平成30年度の解析試薬およびDNA実験試薬の購入費に充当する予定である。具体的には、平成29年度の研究計画の遂行により、SV40 VLPの細胞内侵入経路において相互作用する因子を同定したので、その因子とSV40 VLPとの詳細な相互作用解析を行う。そのために、同定した因子の遺伝子の変異体を構築するために必要なDNA実験試薬を購入するための費用に充当する予定である。また、SV40 VLPと同定した因子との相互作用を解析するため、免疫沈降やウェスタンブロティングなどの解析、さらに、SV40 VLPと相互作用する同定した因子とシグナル伝達関連因子との相互作用を解析するためのDNA実験試薬と解析試薬を購入するための費用にも充当する予定である。
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