2017 Fiscal Year Research-status Report
ランダムなアミノ酸配列ライブラリを利用した抗苦味受容体人工抗体の開発
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16K08426
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| Research Institution | Mukogawa Women's University |
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Principal Investigator |
内田 享弘 武庫川女子大学, 薬学部, 教授 (70203536)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 都 武庫川女子大学, 薬学部, 准教授 (20369028)
伊東 祐二 鹿児島大学, 理工学域理学系, 教授 (60223195)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ペプチド / アミノ酸 / ヒト苦味受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成28年度はKim MJらの文献(Biochem Biophys Res Commun,456, 586-590, 2015)を参考に、3種のペプチドGlu-Glu、Glu-Asp、Glu-Serを合成し、苦味を有する代表的な塩基性薬物であるジフェンヒドラミン塩酸塩、ドネペジル塩酸塩、アムロジピンベシル酸塩の苦味センサ応答に及ぼす各種ペプチドの影響を評価した。各種苦味物質（0.5 mM）の苦味センサ応答は、Glu-Glu（0.1、0.5、1.0、5.0 mM）またはGlu-Asp（0.1、0.5、1.0、5.0 mM）添加濃度依存的に抑制された。
平成29年度は、SPR測定によりペプチドとヒト苦味受容体タンパクの相互作用を評価することを目的に検討を行った。多くの苦味薬物が応答することが知られている苦味受容体タンパク（hTAS2R10, hTAS2R14）に注目して、自己組織化単分子膜（Self-Assembled Monolayer：SAM）を形成した金薄膜に、hTAS2R10, hTAS2R14を固定した。まず、金薄膜をエタノールと超純水で洗浄後、ピラニア溶液中で洗浄した。次に、金薄膜を1 mMチオール溶液（11-Amino-1-undecanethiol 0.96 mg/ethanol 4 mL）に24時間浸漬した（SAM形成）。SAM形成した金薄膜を1%グルタルアルデヒド溶液5 mLに2時間浸漬した後、超純水で洗浄した。金薄膜に、1μg/100μLのhTAS2R10またはhTAS2R14を滴下して表面を覆い12時間静置することで苦味受容体タンパクを固定化させた。金薄膜に苦味受容体タンパクを固定した場合に、固定しない場合と比較してのSPRシグナルの生じる偏光照射角度変化が認められたことから、苦味受容体タンパクが金薄膜に固定されたことが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題では、ヒト苦味受容体の細胞外領域アミノ残基を標的として、アミノ酸20残基をランダム配列した2本の分子鎖をリンカー分子で結合させた人工抗体分子を作製することを目的としている。アミノ酸20残基の配列については、ヒト人工抗体ライブラリのアミノ酸残基配列を参照に、アミノ酸20残基の配列をランダム化したペプチド鎖を複数合成する。平成28年度は、3種のペプチドGlu-Glu、Glu-Asp、Glu-Serに着目してその苦味抑制効果を味覚センサで検証した。平成29年度は、多くの苦味薬物が応答することが知られている苦味受容体タンパク（hTAS2R10, hTAS2R14）に注目して、自己組織化単分子膜（Self-Assembled Monolayer：SAM）を形成した金薄膜にhTAS2R10、hTAS2R14を固定することを検討した。現在までに苦味受容体タンパクの金薄膜への固定を達成し、今後各種ペプチドとの相互作用を評価する準備段階に入っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
hTAS2R14、hTAS2R10のリガンドとして知られているキニーネ、hTAS2R14のリガンドとして知られているジフェンヒドラミン、hTAS2R10のリガンドとして知られているデキストロメトルファンを用いて苦味受容体タンパクとリガンドとの結合解離を測定してその応答を確認した後、各種ペプチドと苦味受容体との結合解離を測定する。ペプチド残基については、４残基から増加させ、分子内に正電荷を与えるLys,Arg,Asp、負電荷を与えるGlu, Aspを導入した、４－残基のペプチドを合成しそれらをランダム化した残基を合成する。
これら種々の合成抗体分子候補物質について、ヒト苦味受容体の細胞外領域アミノ残基との親和性について、複数の細胞外領域アミノ残基をセンサアレイにした分子間相互作用解析（SPR)を行うことにより最適な苦味抑制効果をもつ抗体を探索するシステムを構築する。
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| Causes of Carryover |
アミノ酸20残基の配列については、ヒト人工抗体ライブラリのアミノ酸残基配列を参照に、アミノ酸20残基の配列をランダム化したペプチド鎖を複数合成する予定であったが、当初の予定よりも少ない量のペプチドを使用したため。
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