内耳機能の基盤となる部位特異的な有毛細胞と感覚神経の形成原理の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08453
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 佐藤 滋 自治医科大学, 医学部, 准教授 (70306108)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 内耳形成 / 蝸牛有毛細胞 / 感覚器プラコード / ニワトリ胚 / Cre-loxシステム / ホメオボックス遺伝子 / 転写制御 / エンハンサー

Outline of Annual Research Achievements

Six1有毛細胞エンハンサーの同定を目指し解析を行った。まず、マウスで見られるE15.5からの蝸牛有毛細胞特異的なSix1発現の再活性化が、ニワトリ8-10日胚のbasilar papilla（マウスの蝸牛に相当）においても見られることを確認した。次に、ニワトリ4日胚の耳胞にエレクトロポレーション法によりDNAを導入し、4-6日後に内耳をとり出し、basilar papilla特異的なエンハンサー活性の有無を調べた。四肢動物のSix1周辺で保存された12種類の非コード配列について調べたが、有毛細胞特異的なエンハンサーは発見できなかった。そこで、マウス胚から有毛細胞だけをFACSにより単離し、網羅的な方法（H3K27ac抗体を用いたChIP-sequencing）による検索を試みることに変更し、内耳有毛細胞特異的にEGFPを発現するAtoh1-EGFPマウスを入手した。現在繁殖を行っているが、E16.5の蝸牛有毛細胞特異的なEGFPの発現については確認できた。
Six1の内耳発生後期における機能を調べるためにはSix1-floxマウスが必要である。残念なことに、すでに報告のあるSix1-floxマウスの分与はフランスの研究者に断られた。そのため、理研CLSTとの共同研究として、Six1のエクソン1の前後2ヶ所にflox配列をゲノム編集法（Cas9）にて挿入し、新たなSix1-floxマウスを作製することにした。C57BL/6J受精卵を用い、1本鎖DNAと2本鎖プラスミドをドナーとして用いる2種類の方法での作製を試み、それぞれ、38匹と16匹の新生仔を得ることができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Six1遺伝子周辺で四肢動物で保存された非コード配列に着目したSix1有毛細胞エンハンサーの検索は不調に終わり、フランスの研究者から分与してもらったSix1-floxマウスの利用もできなかった。しかし、H3K27ac抗体を用いたChIP-seqによる検索の準備は順調に進んでおり、数ヶ月中にエンハンサーを同定できると期待している。また、Six1-floxマウスの作製も、すでに新生仔を得て順調に進んでいるため、研究はおおむね順調に進んでいると考えている。

Strategy for Future Research Activity

本計画の具体的目標は、1）シグナルによるSix1活性化機構の解明、2）内耳形成後期でSIX1を欠損するマウスの表現型解析、3）有毛細胞と感覚神経でのSIX1機能の相違点の解明である。前述のように、今年度発生したトラブルは回避できたと考えており、Six1の有毛細胞エンハンサーとSix1-floxマウスを利用した解析も計画通り行うことができる。今後の研究の進め方に変更はない。

Causes of Carryover

Six1の有毛細胞エンハンサーの検索、Six1-floxマウスの入手（作製）がやや遅れているため、いくつかの試薬・キットの購入、受託解析の支払いが、平成28年度ではなく、平成29年度の支出となるため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

上記の項目に予定通り使用する。