上皮細胞間ジャンクションの再編成におけるDLG1の機能解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08462
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 向後 晶子 群馬大学, 大学院医学系研究科, 講師 (20340242)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 向後 寛 群馬大学, 大学院医学系研究科, 講師 (20282387) ; 野村 隆士 藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (20325161) ; 松崎 利行 群馬大学, 大学院医学系研究科, 教授 (30334113) ; 下村 敦司 北海道医療大学, リハビリテーション科学部, 教授 (50340237) ; 松浦 勉 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (80181692)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 聴覚上皮 / 画像解析 / DLG1

Outline of Annual Research Achievements

DLG1は、上皮細胞の極性形成に関わるPZDタンパク質であり、聴覚上皮の収斂伸長に関与する。聴覚上皮発生においては、収斂伸長運動と併行して、偽重層上皮が、有毛細胞と支持細胞からなる重層上皮となり、両細胞の頂部がモザイク状に配置する。収斂伸長におけるDLG1の機能を正確に評価するため、本研究では正常な聴覚上皮の発生過程解明を目的としている。本年度の研究実施内容は以下のとおりである。
①胎仔聴覚上皮ホールマウント標本の蛍光染色顕微鏡写真の画像解析プログラムの開発：聴覚上皮の発生によって生じてくる各種細胞の相対的な位置関係を解析するためには、全細胞の座標を決定する必要があるが、手作業では効率が悪い。そこで各発生段階の聴覚上皮のF-actinを蛍光標識phalloidinで染色し、その蛍光画像をもとに個々の細胞を各領域とするボロノイ図を作成し、各細胞（母点）の平面内座標軸を求めるプログラムを作成した。このプログラムにより、聴覚上皮を構成する全細胞の位置座標を容易に解析に用いることができるようになった。
②聴覚上皮ライブイメージングの準備：聴覚上皮では、細胞分化と組織の収斂伸長が同時に進行するため、各細胞の形態と挙動を追跡するためにはライブイメージングが最適である。現在、試料作製方法、蛍光染色方法、観察方法を検討中である。生細胞の細胞輪郭の可視化のため使用を予定していたスルホローダミンの使用は現在までに良好な結果が得られていないこと、聴覚上皮内では細胞断面が細く、一様な蛍光染色法では追跡が難しいことから、個々の細胞を多重蛍光で染め分けるTgマウスの導入を検討中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

①胎仔聴覚上皮ホールマウント標本の蛍光染色顕微鏡写真の画像解析プログラムの開発：各発生段階の聴覚上皮を構成する有毛細胞、支持細胞の、聴覚上皮組織平面内の分布を追跡するために、phalloidin染色シグナルをもとに個々の細胞を各領域とするボロノイ図を作成し、各細胞（母点）の平面内座標軸を計算するプログラムを作成した。このプログラムを用いて、現在胎生期各段階の聴覚上皮内の各細胞の位置関係を求め、細胞分化状況との関係を検証中である。これについては順調に進捗している。
②聴覚上皮ライブイメージングの準備：聴覚上皮の収斂伸長時の各細胞の挙動を追跡するためのライブイメージングを行うため、試料作製方法、蛍光染色方法、観察方法についての検証を行っている。生細胞の細胞輪郭の可視化のため使用を予定していたスルホローダミンの使用は現在までに良好な結果が得られていないこと、聴覚上皮内では細胞断面が細く、一様な蛍光染色法では追跡が難しいことが判明し、現在次善策を検討中であることから、当初の実施予定計画より遅れている。
③DLG1欠損マウス表現型の解析についての変更点：当初、リン酸化DLG1に対する抗体作成およびDLG1欠損マウスの細胞間ジャンクション再編成におけるDLG1の機能解析について、本年度の実施を予定していたが、これらは現在保留中である。それに代わり、先行して実施した正常発生の解析から、有毛細胞分化および収斂伸長を解析する上では、聴覚上皮組織が、偽重層上皮から重層上皮へと変遷する過程を考慮する必要があることが判明したので、これらを解析する方法を現在検討中である。

Strategy for Future Research Activity

①多重蛍光標識トランスジェニックマウスの導入
聴覚上皮細胞の発生時の挙動を、ライブイメージングにて追跡するため、当初はスルホローダミンで細胞輪郭を描出する計画であった。しかしこの方法だと、聴覚上皮の深層での解像度が不良であり、また上皮で細長く伸びた細胞を頂底方向に追跡するのが極めて困難であることが分かった。そこで今後、各細胞がランダムに多重蛍光標識されるトランスジェニックマウスを導入することで、より精細な細胞配置を観察する。
②上皮組織重層化を視野に入れた聴覚上皮発生時細胞挙動の解析
聴覚上皮発生では、収斂伸長と並行して有毛細胞および支持細胞への分化と、上皮の重層化が起こる。これら複数の現象の相対的なタイミングはこれまで知られていなかったが、これまでの我々の研究で、外有毛細胞が分化マーカーであるミオシンVIを発現し始める以前に、これらの細胞の核が組織の基底部から上層に移動してくることが判明した。もしも、この核の移動が、細胞の重層化によるもので、この時点で聴覚上皮が重層化しているならば、この後に起こるとされている聴覚上皮の収斂伸長では、組織の頂底両面に顔を出す支持細胞と、頂部面だけに顔を出す有毛細胞との間で細胞再配置が行われていることになる。また、聴覚上皮細胞の再配置について我々は、収斂伸長の過程で、支持細胞間ジャンクションの角度が変化すること、DLG1欠損マウスでこの変化に異常が見られることを見出しているが、その意義は解明できていない。そこで、上述の多重蛍光標識Tgマウスのライブイメージングにより、収斂伸長過程の聴覚上皮細胞の、xy平面内、z軸方向の運動パターンを明らかにするとともに、この過程におけるDLG1の機能を検討する。

Causes of Carryover

ライブイメージングに用いる培養および撮影機材を購入しなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

機器が高額のため、培養条件、撮影条件を整えたうえで、最適な機種を選定する必要があるが、平成28年度中にこれらの最適条件を定めるに至らなかったため、これらを平成29年度に行う予定である。また、購入の前に、試用できる機会、さらには、他機関に設置された機器を借用できる可能性についても積極的に模索したい。