2017 Fiscal Year Research-status Report
RETチロシンキナーゼの活性化レベル変動と神経系形成異常の相関についての検証
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16K08466
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
上坂 敏弘 神戸大学, 医学研究科, 講師 (90304451)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Retチロシンキナーゼ / 変異体ノックインマウス / 恒常的活性型チロシンキナーゼ / 神経栄養因子GDNF / 腸管神経前駆細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
RET(C618F)の変異体はRETチロシンキナーゼの活性化レベルが恒常的に少し高められた状態になっていることをこれまでに見出している。このRET(C618F)の変異体１コピーだけの遺伝子座を有するマウスは、主に小腸の下部以降において腸神経節を欠損し、頻度は低いが、神経節欠損部位を挟んだスキップ型の腸神経節形成を生じることを見出した。これまでは、腸の神経節が先天性に欠損する疾患の原因遺伝子としてRETは知られており、腸管ニューロン前駆細胞の移動、増殖、分化に必須であるRETの機能消失により腸神経節の欠損に陥ると考えられてきたが、本研究のマウスモデルは、RETの活性化レベルが少し高まることで、細胞移動とニューロン分化誘導のバランスが崩れることによっても神経節形成不全が生じることを見出した。実際にRETの活性化の引き金となるリガンド神経栄養因子GDNFの遺伝子座一つ欠損させたヘテロ接合体マウスと掛け合わせて、GDNFの発現レベルを抑えることでRET(C618F)の変異体の腸神経節形成異常を抑えることをみており、RETの活性化レベルの上昇が原因であることが強く示唆された。
このRet変異マウスにおけるスキップ型の神経節形成に、Retに依存しないシュワン細胞系譜からのニューロン新生が寄与しているのではないかと仮定し、シュワン細胞系譜の細胞のRetを欠損し、その際、蛍光タンパク質mCherryで標識されるようDhh::CreドライバーおよびloxP レポーターシステムを組み合わせて、Retを欠損したシュワン細胞系譜解析を行った。その結果、大腸に形成される神経節のニューロンの半数以上がシュワン細胞系譜であることが示唆され、さらにRET非依存的にニューロン新生、神経節形成が生じることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Ret変異マウスの表現型に基づく解析は、Retの活性化に寄与するリガンドである神経栄養因子GDNFの発現レベルを下げることによるレスキュー実験も予想通りの結果となり、RETの活性化レベルが高まっていることが原因であることを示唆できた。また腸管神経節欠損部位に形成されるニューロン新生にシュワン細胞系譜が寄与していることを示す成果も得られている。マウスモデルを用いた実験は順調に成果が得られたのに対し、一方、マウス由来の細胞の主題培養系を用いたRETの下流シグナル探索については、現在まだ解析に至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
Ret変異マウスから単離した細胞を培養し、RET下流のシグナル経路を探る解析については、Ret変異マウス由来の細胞培養、維持が難しく、解析に必要な十分な細胞数を確保することが、困難なため、進んでいなかった。そこで、neurosphere法などで細胞を増やす条件検討を進め、分子メカニズム解明の足掛かりとなる、因子の探索を進める。今後はマウスの組織解析から、初代培養系の細胞解析に少し重点を置き、分子機構の解明を目指した基盤研究を展開する。
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| Causes of Carryover |
Ret変異マウスから単離した細胞の初代培養系の実験が当初の計画のように進まなかったため、予定していた解析が行えなかった。次年度使用額を合わせて、次年度に重点的に培養細胞系の実験により、分子機構の解明を目指す予定である。
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