2016 Fiscal Year Research-status Report
高感度蛍光in situハイブリダイゼーション法によるmicroRNA発現解析
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16K08471
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
菱川 善隆 宮崎大学, 医学部, 教授 (60304276)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石塚 匠 宮崎大学, 医学部, 助教 (50700085)
川口 真紀子 宮崎大学, 医学部, 助教 (90405598)
チョウジョウフ ナランツオツク 宮崎大学, 医学部, 助教 (90640962)
ピュー シンウー 宮崎大学, 医学部, 助教 (90718123)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 蛍光共鳴エネルギー移動 / in situ hybridization / 28S rRNA / microRNA / miR-122 / ラット肝臓 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高感度蛍光発色（Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET；蛍光共鳴エネルギー移動）を利用して、組織切片上で特定の細胞での小分子非翻訳RNAであるmicroRNA (miRNA)発現動態を解析する新たな検出法として、FRET based in situ ハイブリダイゼーション(FRET-ISH)法を開発し、組織・細胞レベルでのmiRNA局在検出法を確立することを目的として、本年度は我々が通常陽性コントロールとして用いている28S rRNA配列を基にしたmiRNA用ハイブリダイゼーション条件の最適化を行った。
具体的には、標的とするmiRNA自体の配列が25塩基以下と非常に短いことより、大量に組織内に発現し、通常のISH陽性コントロールとして用いている28Ｓ rRNA検出プローブ（39塩基数）から22塩基数の短いプローブ配列を選択して、2種類のFRET標識プローブを作製した。ラット肝臓パラフィン及び凍結切片を用いて①プローブ濃度、②ハイブリダイゼーション温度、③ハイブリダイゼーション溶液組成、④ハイブリダイゼーション反応時間と洗浄条件、を中心に検討して小分子RNA検出のためのFRET-ISH法の最適な条件検討を行った。その結果、通常のISH法よりも高温かつ短時間のハイブリダイゼーションで28S rRNAの検出に成功した。現在、肝臓をはじめ様々な組織・細胞で豊富に存在するmiR-122に対するFRET-miR-122プローブを作製し、ステップ①での諸条件を基にして最適化を図り、このmiR-122を組織内miRNA検出陽性コントロールの指標とすべく、解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
高感度蛍光発色（Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET；蛍光共鳴エネルギー移動）標識した通常より短い28S rRNA検出プローブを用いてFRET-ISH法の条件を検討し、組織内での特定のｍRNAの検出に成功した。
現在、microRNA-122 (miR-122)検出用プローブの作製を行い、織切片上でmiR-122の発現動態を解析中であり、研究計画はおおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度のFRET-ISH法用の諸条件を基にして、miR-122の組織内発現動態をラット正常肝臓組織で明らかにするとともに、今後、主に細胞増殖・分化・再生あるいはがん化など多様な生命現象に関与するmicroRNAの内、肝組織で高発現することが知られているmiR-21に対するFRET-miR-21プローブを作製し以下の研究に用いる。ステップ②のmiR-122発現は陽性コントロールとして常に用いる。ラット70％肝切除モデルを作製し、肝再生過程でのmiR-21の発現動態についてFRET-ISHで経時的に検討するとともに、増殖活性（PCNA）、IL-6、増殖因子（HGF、KGF）との関連について免疫組織化学で検討する。また、肝切除で残った左葉にエレクトロポレーションによりラットmiR-21に対するlocked nucleic acid (LNA) miRNAインヒビターを導入してmiR-21発現抑制実験を行い、miRNA制御による人為的な細胞制御の可能性を検討する予定である。
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Research Products
(18 results)
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[Journal Article] Discrimination of Stem Cell Status after Subjecting Cynomolgus Monkey Pluripotent Stem Cells to Naïve Conversion.2017
Author(s)
Honda A, Kawano Y, Izu H, Choijookhuu N, Honsho K, Nakamura T, Yabuta Y, Yamamoto T, Takashima Y, Hirose M, Sankai T, Hishikawa Y, Ogura A, Saitou M.
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Journal Title
Sci Rep
Volume: 7
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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