2017 Fiscal Year Research-status Report

ウイルスを載せて『滑走』するラフトの巨大クラスタリングとそのドライビングフォース

Research Project

Project/Area Number	16K08477
Research Institution	Fujita Health University
Principal Investigator	野村隆士藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (20325161)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	向後晶子群馬大学, 大学院医学系研究科, 講師 (20340242) 下村敦司北海道医療大学, リハビリテーション科学部, 教授 (50340237) [Withdrawn] 塚本健太郎藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (80434596)
Project Period (FY)	2016-10-21 – 2019-03-31
Keywords	コロナウイルス / カベオラ / ＣＤ１３
Outline of Annual Research Achievements	ウイルスの細胞への感染初期過程を知ることは，ウイルス感染の防御法，治療法などを考える上で重要である。感染初期過程には大きく２つのステージ，①『吸着』（ウイルスが細胞膜に結合すること），②『侵入』（ウイルスが細胞内に入ること）があると考えられている。『吸着』は，細胞膜上にある特異的レセプターにウイルスが結合することを意味する。『侵入』は大きく２つの経路が提唱されており，（１）細胞のエンドサイトーシスを利用して侵入する経路と，（２）細胞膜とウイルスエンベロープとの膜癒合により侵入する経路である。この吸着，侵入に関しては，これまで様々なウイルスに対してその詳細が報告されているが，吸着部位と侵入部位は暗黙的に“同じ”であると考えられている事例が多いようである。研究者らはヒトコロナウイルスの一種が吸着後，細胞膜上をカベオラまで滑走し，カベオラから細胞内に侵入することを報告した。一般的に，ウイルスが細胞膜上に吸着する際，ウイルス粒子１個あたりに対し，多数のウイルスレセプターをウイルス直下に架橋することが想定される。そこで，ヒトコロナウイルス-229EのレセプターであるCD13をウイルスの代わりに抗体で架橋し，その抗体の動態を解析した。架橋CD13は細胞膜上で直線的な配向を示しながらクラスタリングする像が認められた。この配列が起こる原因として，アクチンフィラメントによる可能性を考え，その動態を観察したところCD13と同様の現象を認めた。重合阻害剤などの結果から，CD13のクラスタリングは，アクチンフィラメントに依存して起こる可能性が高いと考えられた。得られた大量のタイムラプス動画から，アクチンフィラメントの移動速度と，CD13のクラスタリング速度等の関連性などを細かく解析する必要性を感じている。また，多重蛍光標識ウイルスに関しては，現在なかなかうまく行っていない。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason タイムラプス動画のファイルサイズは膨大であり（５GB/ファイル），作業効率の改善を試みる必要がある。蛍光標識ウイルスタンパク質を恒常的に発現する細胞を用いて，多重蛍光標識ウイルスの作成を試みたが，どうやらウイルス粒子のパッケージングの際に蛍光標識ウイルスタンパク質ははじかれてしまうような感じを受けている。
Strategy for Future Research Activity	平成29年度の実績を踏まえ，以下の実験計画を考えている。１）CD13以外のラフト分子，非ラフト分子の動態を検討する。２）CD13のクラスタリングとアクチンフィラメントの動態を詳細に比較解析する。３）蛍光ウイルスタンパク質遺伝子を持つstableクローンを用いた多重蛍光標識ウイルスの作製を継続する。
Causes of Carryover	金額の大きな以下２件が大きな理由。１）顕微鏡取得画像の解析ソフトウエア（671,025円）を当該年度内に納品される予定であったが，メーカー（Carl Zeiss社）の都合で年度内納品が不可となってしまったこと。２）培養細胞の保存に使用する液体窒素凍結保存容器（245,000円）も年度内に納品される予定であったが，発注後にメーカー（クライオワン社）在庫がなくなってしまい，バックオーダー状態になったこと。上記２つとも，H30年4月時点で納入されている。