2016 Fiscal Year Research-status Report
腎集合管B型間在細胞の酸塩基バランス機構：Ca感知受容体のシグナルネットワーク
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16K08505
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
安岡 有紀子 北里大学, 医学部, 講師 (50348504)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 雄一 北里大学, 医療衛生学部, 教授 (30178793)
野々口 博史 北里大学, 北里大学メディカルセンター, 部長(医師) (30218341)
河原 克雅 北里大学, 医学部, 教授 (70134525) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | カルシウム感知受容体 / 腎集合管 / 間在細胞type-B / アルカリ分泌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血液中のCa濃度が、集合管間在細胞type-B (IC-B)のカルシウム感知受容体(CaSR)を介してHCO3-分泌に影響しているか否かを調べるため、高Ca血症モデルマウスの作製を検討した。
1)高カルシウム食（2.5% Ca）[塩化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム]、低カルシウム食（0.05% Ca）をマウスに7日間負荷した。血漿Ca濃度が有意に増加したのは、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム負荷食であった。しかしながら、塩化カルシウム負荷マウスの尿pHは有意に低下し、クエン酸カルシウム負荷マウスの尿pHは有意に増加していた。カルシウム負荷実験では、血漿Ca2+濃度と尿pHに相関関係はなかった。
2)低リン食（0.02％ Pi）をマウスに7日間負荷した。血漿Ca濃度は増加し、尿pHも有意に増加していたが、血漿pHは有意に低下していた。また、血漿Pi濃度は正常値に維持されていた。集合管IC-BのCaSR、Pendrin mRNAは増加し、IC-AのH-ATPase、AE1 mRNAは減少していた。
以上の実験から、高カルシウム食を負荷した場合は、各カルシウム塩の性質（酸およびアルカリ）が影響し、カルシウムによる酸・アルカリ排泄能を解析することは困難であると考えた。一方、低リン食負荷時に血漿Ca濃度を上昇させているカルシウムはマウス自身の骨由来であり、アシドーシスであるにもかかわらず尿pHが増加（アルカリ化）していた。CaSRの機能解析を行うのに最も適した高Ca血症モデルマウスは、低リン食負荷マウスであることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1) 高Ca血症、低Ca血症モデル作製の検討： 各種カルシウム塩を負荷、または低カルシウム食、低リン食を7日間、または28日間負荷し、血漿Ca濃度の変化を計測した。すべての実験系で、7日間ですでに血液・尿データに変化が得られたため、以後、28日間負荷動物は使用せず、7日間負荷動物のみを使用することにした。上記実験により、低リン食負荷（7日間）により、カルシウム感知受容体を機能解析ための最も適した高Ca血症モデルマウスを得た。低カルシウム食負荷は、28日間経過しても血漿Ca濃度が低下することはなく、他の実験系により低Ca血症モデルマウスの作製を検討する必要がある。（達成度 80 %）
2) 低リン食負荷マウス（高Ca血症）の腎集合管の酸・アルカリ分泌能の解析： 酸分泌を担う腎集合管間在細胞type-Aに発現するH-ATPase、AE1は発現が低下し、アルカリ分泌を担う間在細胞type-Bに発現するPendrin、AE4、CaSRは発現が増加することを、免疫染色法、in situ hybridization法により確認した。（達成度80 %）
3)IC-B細胞株の樹立： 腎集合管間在細胞株（IN-IC細胞）からIC-Bを単離し細胞株を作製予定であったが、形質が変化したためかIC-Bのマーカーとなるpendrinの発現が消失し、単離することが困難になった。そのため、Pendrinのpromoter下にレポーター遺伝子(mCherry)を配置し、IC-Bに特異的に蛍光蛋白を発現する遺伝子組換え動物を作製することにし、現在進行中である。（達成度50 %）
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度に引き続き、低Ca血症モデルマウスの作製を検討する。一方で、CaSR活性化薬（NPS R-568）、阻害薬（NPS2143）を使用し、CaSRを介したシグナルを精査する。方法としては、各試薬をマウスに腹腔内または静脈に投与し、血液・尿成分を解析する。腎臓のmRNA、タンパクは、ISH法、IHC法、western blotting法などにより、酸塩基調節分子の発現変化を解析する。
IC-B特異的に蛍光を発現するマウス作製を進行させる。作製が完了した後、SV40 T-antigen Tgマウスを交配し、得られたdouble TgマウスのIC-B細胞を単離し細胞株を樹立する。酸、アルカリ負荷により、各種酸塩基調節関連遺伝子（Penerin, AE4, Foxi1等）の発現変化を解析する。また、RNA-seqにより、アルカリ負荷後に発現量が変化する遺伝子群を同定する。
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| Causes of Carryover |
3月に発注した物品が輸入となってしまったため納品が遅れ、支払いが次年度になってしまった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
概ね計画通りに経費を使用しており、次年度も研究計画に則り、経費を使用する予定である。
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