2016 Fiscal Year Research-status Report

ATP放出性Maxi-Clチャネル関連分子の解析

Research Project

Project/Area Number	16K08510
Research Institution	National Institute for Physiological Sciences
Principal Investigator	岡田俊昭生理学研究所, 生体機能調節研究領域, 特任准教授 (00373283)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	anion channel / Maxi-Cl / 分子同定
Outline of Annual Research Achievements	Maxi-Cl（マキシアニオンチャネル）は200-500pS の大きなシングルチャネルコンダクタンスとlinear でsymmetrical なI/V関係を特徴とするアニオンチャネルである。また様々な生理学的または病態的局面においてチャネルポアを通して細胞外へのATP 放出をおこなうATP 放出性チャネルの候補としても知られるが、その分子実体は不確定な状態が続いている。我々は最近、マウス細胞においてMaxi-Cl 電流の発生やそれに伴うATP 放出に重要だと考えられる分子を新規に同定した。本研究は同定された分子がチャネルのポアを構成する成分であるか否かを明らかにすることを主目的とし、以下の実験を計画した。 1）ゲノム編集技術を用いたMax-1ノックアウト(KO)細胞系の作成及び解析。Max-1のKOがMaxi-Cl 機能に与える影響をパッチクランプやATP 放出実験により解析する。 2）substituted cysteine accessibility method（SCAM 法）を用いたMax-1 変異分子の作成及び解析。SCAM 法を用いて細胞内/外からアクセス可能な膜貫通ドメイン荷電アミノ酸を探索し、その変異がMaxi-Cl 電流のポア性状に与える影響を電気生理学的に解析する。 3）Max-1 特異抗体の作成。特異抗体を作成し、ノックアウト細胞を含む種々の細胞においてMax-1分子の発現とMaxi-Cl 電流との間に普遍的な関連性が存在するか調べる。平成28年度の実績の概要は1）についてはKO細胞系列を作成する細胞種を選択し、予備実験を行った、2）Max-1変異分子の作成に関しては予定に従って進めた、3）については予定通りMax-1タンパクのC末端配列を抗原としてポリクローナル抗体を作成した、となった。よって2）、3）の計画については必要な準備がおおむね整ったと考える。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 実験計画1）については遅れている。28年度はMax-1KO細胞を作成するにあたって、Maxi-Cl電流を豊富に発現しているマウスL929細胞株を選択した。しかしこの細胞はクローニングの為に限界希釈して単一細胞で培養すると増殖せずその後死滅することがわかった。その為、現在この計画は進展していない。計画2）についてはおおむね順調に進んでいる。SCAM法を行うにあたっては、Max-1タンパクの膜貫通領域のアミノ酸、本研究では主に荷電アミノ酸をCysに置き換えるのだが、事前に内在性のCysを他のアミノ酸（Ser）に置換する必要がある。通常のPCRを介した変異導入やDNA assembry 法を利用して現在、内在性のCys/Serの置換は殆ど終了している。またSCAM法によらないMax-1変異分子も作成し、その一部については電気生理学的な解析を始めた。計画3）についてはおおむね順調に進んでいる。抗体を作成するにあたってはC末端のアミノ酸配列を抗原として選択した。その後、専門の業者に依頼してポリクローナル抗体を含む抗血清を作成した。作成した抗血清を用いてウエスタンブロッティングを行ったところ、細胞に強制発現させたMax-1タンパクを認識した。一方で、内在性のタンパクはこれまでのところこの抗血清では検出出来ていない。しかし、以前、Max-1に関連する他の実験において市販の抗体を3種類、購入して試したがあるが、いずれも強制発現させたMax-1タンパクすら認識しなかったことを考えると今回の抗血清作成は悪い結果ではないといえる。
Strategy for Future Research Activity	研究計画1）は現在計画2）,3）に比べ遅れている。今後の対応策としては、実験に用いる細胞種を変更する、培養法やクローニング方法を変更してL929細胞を引き続き使用する、ことが考えられる。前者の方がより簡便で現実的な対処だと考えられるが、低密度培養による増殖能の低下はL929のみならず様々な細胞種においても起こりうることなので、後者についても留意、検討する。計画2）については、29年度は電気生理学的な解析が主となる。現在作成中のMax-1変異分子をMax-1KO細胞または内在性Maxi-Cl電流非発現細胞へ強制発現させて電流を記録し、SCAM 法を用いて細胞内/外からアクセス可能な膜貫通ドメイン荷電アミノ酸を探索する。それらの荷電アミノ酸における変異によって、電流の特性やチャネルを透過するイオンの選択制に生じる変化を解析し、Max-1がMaxi-Clチャネルのポアを構成分子であるか否かを検討する。電気生理学的解析については研究室に所属する研究協力者に手伝っていただく予定だったが、研究室のあり方が大きく変化したことによりそれが困難となった。そこで28年度後半から研究代表者自身で電気生理の技術を学び現在実践している。計画3）において作成した抗血清は、現時点では強制発現させた多量のMax-1タンパクは検出するが、内在性の少量の抗原をウエスタンブロッティングで検出できていない。今後はサンプルの調整法など実験条件をさらに検討したい。また、抗血清に含まれる抗体をIgG分画へ精製、濃縮しバックグラウンドを減らしつつ高濃度の使用にも耐えるようなものにした上で、実験に用いることも併せて行いたい。
Causes of Carryover	28年度は他の研究課題に関する論文を2報準備し、1報はジャーナルに投稿後、比較的順調に受理まで至ったが、他の１報はリバイズで多くの追加データを求められたことから、それに関する実験に時間を大きく割かざるを得なかった。その為、本課題研究の進捗がやや遅れ、経費の未使用が生じた。また29年度は研究室のあり方が大きく変わり全体的に経費が不足することが予想されたため、28年度はやや出費を控えたことも次年度使用額が生じた原因となった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	前述したように29年度は、28年度までとは研究室のあり方が大きく変わり、科研費で人員を確保する必要性が生じた。そのため、当初の計画では予定していなかったが、次年度使用額の大半は技術補助員を雇用するための人件費として使用したい。