2018 Fiscal Year Research-status Report
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16K08510
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
岡田 俊昭 生理学研究所, 生体機能調節研究領域, 特任准教授 (00373283)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | anion channel / Maxi-Cl / ATP release |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Maxi-Cl（マキシアニオンチャネル）は200-500pS の大きなシングルチャネルコンダクタンスとlinear でsymmetrical なI/V関係を特徴とするアニオンチャネルである。また様々な生理学的または病態的局面においてチャネルポアを通して細胞外へのATP 放出をおこなうATP 放出性チャネルとしても知られる。我々は最近、マウスC127細胞においてMaxi-Cl 電流の発生やそれに伴うATP 放出に重要だと考えられる分子、MAC-1＝SLCO2A1を新規に同定した。本研究は同定された分子がMaxi-Clチャネルのポアを構成する成分であるか、それとも制御因子であるかを明らかにすることを主目的としている。また、これまでMaxi電流の存在が報告されている様々な細胞においてもSLCO2A1がそれらの電流の発生に関わっているか、つまりSLCO2A1の発現とMaxi機能（電流の発現やATP放出）の発現の間に普遍性が存在するかを示すことも目的としている。
30年度はこれまでにMaxi電流の存在が報告されている細胞を含む種々の細胞株（L929, Mouse embryonic fibroblast: MEF, mouse C6 glioma cell）を用いて、SLCO2A1の発現とMaxi電流の発生及びATP放出との関連性について調べた。内在性のSLCO2A1発現と電流の発生、ATP放出の間には正の相関がみられた。しかし、SLCO2A1の発現をsiRNAによりノックダウンした場合に、SLCO2A1の発現と電流量の間に相関がみられない細胞があり、またATP放出に関してはこれまでのところ全く相関が観察されず、仮説と矛盾が生じている。これらの結果の一部は、30年度3月に第9回FAOPS大会においてポスター発表を行った。また、この研究に関連したレビューを共著者として2報発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
SLCO2A1はプロスタグランジントランスポータとして働くことが知られている分子であるが、我々はプロスタグランジントランスポータとしての機能を阻害する数種の薬剤がMaxi電流ブロッカーとして働くことを示している。種々の細胞株を用いて電流の観察をおこなう際には、これらの薬剤による効果も観察している。またチャネルのイオン選択性についても観察している。L929細胞はSLCO2A1の発現量が他の2種の細胞株より多く、電流量も多い。siRNAによるSLCO2A1のノックダウンで電流量が減少し、また上記ブロッカーの電流抑制効果も観察され、イオンの選択性についても以前示されたMaxi-Clのそれと同様であることなどから、L929細胞に発現している電流はSLCO2A1が関与するMaxi-Cl電流であると考えられる。しかしながら、低浸透圧刺激誘導性ATP 放出に関してはSLCO2A1のノックダウンにより放出量が減少せず、寧ろ若干ではあるがその量が増加した。MEF細胞ではSLCO2A1のノックダウンによりATP放出量が大きく増えた。ATP放出量の計測にはデリケートな実験操作が要求されるため、何度も実験を繰り返したが仮説に沿う結果は得られなかった。しかしATP 放出はMaxi-Clの持つ生理的に重要な特性であり、この矛盾については必ず理由を明らかにしなければならない。このことが30年度の実験計画の進捗を妨げた大きな原因となった。今年度行う予定だったSLCO2A1変異分子の解析は殆ど進めることが出来なかった。これらのことから、研究期間を一年延長した。
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| Strategy for Future Research Activity |
【５.研究実績の概要】に記載のように、この課題の主目的は「Maxi-Clチャネルのポアを構成する成分であるか否かを示す」と「SLCO2A1の発現とMaxi機能の発現の間に普遍性が存在するか」である。前者に関しては、2017年度に一定の成果を出し、データの一部を論文として発表もしているのだが、さらにこの結果をサポートするデータを得るためにSLCO2A1変異分子の解析は今後も続けて行う必要がある。SLCO2A1変異分子については既に十分な数の変異体を作成しているので、今年度はそれらを用いた電気生理の実験を集中的に行なう。
一方で、「SLCO2A1の発現とMaxi機能の発現の間に普遍性が存在するか」を示す実験は仮説と異なる実験データが得られ、その為に進捗が遅れているのでこの状況を打開しなければならない。特にSLCO2A1のノックダウンによるATP放出量の増加という現象は必ず何らかの原因を見出さなければならない。考えられるのはMaxiチャネル以外の、別のATP放出経路が代償的に働いてしまうという可能性である。低浸透圧刺激誘導性ATP放出の放出口として考えられるのはヘミチャネルであるPANNEXIN 1が挙げられる。今後、PANNEXIN 1のノックダウン、PANNEXIN 1とSLCO2A1のダブルノックダウンをおこない、それらがATP放出に及ぼす効果を検証する。またチャネルを通らない小胞からのATP放出経路も考えられるので、それらの阻害剤の効果も検証する。
なお、2019年度は研究計画の最終年度に当たるので、少なくとも年度の後半からは論文の作成等、成果の発表作業も並行して行うよう努めたい。
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| Causes of Carryover |
当初、技術補助員を数か月雇用することを考えていたが、その予定が変更となったため次年度使用額が生じた。また、本来30年度までの研究期間であったが、研究の遅れもあって研究期間の延長を申請した。そのため次年度分の研究経費が必要となり、30年度末期には助成金の使用をやや控えた。
次年度は助成金は主に実験消耗品の購入と成果発表のために使用を予定する。
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Research Products
(3 results)
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[Journal Article] Cell Volume-Activated and -Correlated Anion Channels in Mammalian Cells: Their Biophysical, Molecular and Pharmacological Properties.2019
Author(s)
Y. Okada, T. Okada, K.S. Numata, M.R. Islam, Y.A. Akatsuka, T. Numata, M. Kubo, T. Shimizu, R.S. Kurbannazarova, Y. Marunaka, and R.Z. Sabirov
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Journal Title
Pharmacological Reviews
Volume: 71
Pages: 49-88
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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