2016 Fiscal Year Research-status Report
不活性型ノックインマウスを用いてカルモジュリンキナーゼⅡの基質蛋白質を探索する
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16K08511
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
山肩 葉子 生理学研究所, 助教 (20210338)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 蛋白質リン酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIα（CaMKIIα）は、シナプス可塑性や海馬依存性の学習・記憶に不可欠な分子として知られている。学習・記憶の本質的なメカニズムを追究し、ヒト疾患の予防・治療に貢献するためには、CaMKIIαの下流のシグナル伝達を探ることが重要である。しかしながら、学習・記憶の成立に不可欠なCaMKIIαの基質蛋白質についての知見は未だ乏しく、特に生体組織を用いた実験では十分な成果を上げていない。本研究では、学習・記憶障害を特徴とする不活性型CaMKIIαノックインマウス（CaMKIIα-KI）を活用することにより基質蛋白質探索の特異性を上げ、さらに、行動実験と組み合わせることにより、学習・記憶の成立に本質的な役割を果たすCaMKIIαの基質蛋白質の同定を目指す。
本年度は、野生型マウスとCaMKIIα-KIマウスの脳ホモジネートを用いて、内在性のCaMKIIαによって特異的にリン酸化される基質蛋白質のスクリーニングを行った。具体的には、それぞれの脳ホモジネートに、放射性ラベルしたATPを加えて、Ca2+/カルモジュリンの存在下と非存在下で、内在性のキナーゼによってリン酸化反応を起こさせ、電気泳動にて展開し、野生型マウスとCaMKIIα-KIマウス間で、ATPを取り込んだリン酸化蛋白バンドを比較した。その結果、内在性のCaMKIIαによってリン酸化される複数の蛋白バンドを見出した。また、この実験と並行して、野生型マウスとCaMKIIα-KIマウスを用いた行動実験を行い、CaMKIIα-KIマウスに特異的な学習・記憶障害についての解析を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
野生型マウスとCaMKIIα-KIマウスの脳ホモジネートを用いてリン酸化を行うことにより、内在性のCaMKIIαによって特異的にリン酸化される基質蛋白質の候補を見出せた。
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| Strategy for Future Research Activity |
候補となるCaMKIIαの基質蛋白質の解析・同定を進める。具体的には、これらリン酸化蛋白質を分離・抽出し、ペプチド断片とし、高速液体クロマトグラフィー・質量分析法によって、解析・同定する。また、有望な蛋白質に対してリン酸化特異抗体を作製し、学習・記憶の際にこれらのリン酸化が増大するかどうかについて、検証する。
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| Causes of Carryover |
既存の設備を最大限活用することにより、節約に努めた。また、現存機器を活用できる実験を優先的に行った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
新たな実験のための機器、試薬、実験動物の購入等、計画的に執行してゆく予定である。
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