2017 Fiscal Year Research-status Report
Clearance mechanism of ADAMTS13
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16K08515
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
秋山 正志 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (30298179)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小亀 浩市 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (40270730)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ADAMTS13 / クリアランス機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は障害を受けた障害を受けた血管のコラーゲンと血小板、血小板同士を接着させる役割を持つVWFマルチマーを特異的に切断することで血栓形成を抑制的に調節している血中メタロプロテアーゼADAMTS13のクリアランスに関与する受容体の同定およびその機能解析である。はじめにLDL Receptor-related protein 1 (LRP1)、Sialic acid-binding Ig-like lectin 5 (SIGLEC5)、ヘモグロビンスカベンジャー受容体として知られ最近ADAMTS13の取り込みに関与すると報告されたCD163を含むいくつかのADAMTS13のエンドサイトーシス受容体候補をHEK293細胞上に安定発現させ、研究室で精製した組換えADAMTS13の取り込みを検討した。その結果、SIGLEC5がADAMTS13のエンドサイトーシスに関与している可能性が明らかとなった。ADAMTS13の全長（アミノ酸残基番号76－1427)およびN末側領域MDTCS（アミノ酸残基番号76-685）の2種の組み換えタンパク質の両方ともにSIGLEC5発現細胞で親株よりも細胞内への取り込みが促進されることから、SIGLEC5による取り込みに関与するADAMTS13の領域がN末側領域内にも存在していることも明らかとなった。蛍光標識したADAMTS13リガンドを培地に加えてSIGLEC5発現細胞と4C,60分間インキュベーションするとADAMTS13の細胞の表面（の受容体）への結合による蛍光が細胞表面で観察された。一方で最近、ADAMTS13の取り込みに関与すると報告された1本鎖膜貫通型タンパク質CD163を発現させたHEK293 細胞を用いて取り込み実験を行ったが、明確な取り込みは観察できなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本来の計画においては28年度においてはクリアランス受容体の可能性が高いと考えていた受容体候補の同定を目指していたが、発現細胞におADAMTS13の取込みが観察されなかった。これは条件検討の結果、我々が使用していたADAMTS13抗体の特異性と感度に問題があったことによることが29年度になり明らかとなった。そこで組換えADAMTS13を直接アミドラベルにより蛍光標識して取り込み観察を行うことで、SIGLEC5がADAMTS13の取り込みに関与することが明らかとなったが本来予定していた実験計画に較べて遅れが出てしまった。また研究開始後にADAMTS13のクリアランスに関与する受容体としてCD163を同定したとする論文が発表されたが、我々の実験条件下では取り込みへの関与がはっきりしないことで研究方針がなかなか定まらなかったことも遅れにつながった。今後できるだけ早く論文作成に必要な実験を行い論文にまとめる予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ADAMTS13は血中タンパク質であり、基質であるVWFや多くの凝固因子同様にマクロファージによりクリアランスされる可能性が高い。我々が本研究でADAMTS13の取り込みに関与すると明らかにしたSIGLEC5は最近クリアランスに関与すると報告されたCD163同様にマクロファージ上に高発現していることが知られている。そこで今後研究室の単球由来細胞株でのSIGLEC5発現を調べて、SIGLEC5発現細胞をin vitroでマクロファージ様細胞に分化させ、より生体に近い条件下でADAMTS13の取り込みを観察する予定である。また、我々が精製した組換えADAMTS13（全長及びMDTCS領域）とSIGLEC5の細胞外ドメイン（アミノ酸残基番号17-434）とヒトFcとのキメラタンパク質（可溶性発現が可能でかつネイティブ受容体と同様に二量体を形成することができる）との親和性をELISAを用いて調べる予定である。またADAMTS13のクリアランスにおけるマクロファージの生理学的な重要性を検証するために、マウスにクロドロン酸内包リポソーム を投与してマクロファージを枯渇させた場合の投与ADAMTS13のクリアランスを調べることも検討するとともに論文作成を急ぎたい。
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| Causes of Carryover |
当初の研究計画において29年度に行う予定であった実験が進捗状況の遅れによって30年度に持ち越すことになったため。
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