2017 Fiscal Year Research-status Report

ゲノム編集によるエストロジェン膜受容体欠失ラット作製と細胞増殖抑制機構の解明

Research Project

Project/Area Number	16K08522
Research Institution	University of Yamanashi
Principal Investigator	三井哲雄山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (20402084)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	エストロジェン / 下垂体 / 遺伝子発現 / 細胞増殖 / ゲノム編集
Outline of Annual Research Achievements	下垂体前葉プロラクチン産生(PRL)細胞の増殖に対するエストロジェン（E2）の作用について調べた結果、insulin-like growth factor-1(IGF-1)等の成長因子の存在下では、E2は細胞増殖を抑制する。この細胞増殖抑制作用に関与する遺伝子を同定するため、我々の先行研究では、DNAマイクロアレイ法によりE2による発現変動遺伝子を調べた。その結果、E2による増殖抑制作用に伴い、発現変動する遺伝子を複数見出した。そのなかで、デキサメサゾン誘導Ras関連タンパク質（Rasd1）に着目し、Real-time PCR法により発現変化を詳細に調べた。その結果、E2投与30分後には発現が増加し、1時間後にピークに達し、数日間発現増加が持続した。この作用は、エストロジェン受容体（ER）を発現する、ラット下垂体腫瘍細胞株(GH4C1細胞)でも同様に見られた。PRL細胞のRasd1発現を短鎖ヘアピンRNA（shRNA）により抑制したところ、E2により発現変化するPim3とIgf1発現は減少し、Giot1発現は増加した。さらに、Rasd1発現の抑制により、E2投与24時間後のPim3発現を増強し、Fosl1 発現の抑制を減弱させた。また、Rasd1発現の抑制により、CRE、AP-1およびSREプロモーター活性を増強した。これらの結果は、PRL細胞においてRasd1がエストロゲン応答性初期遺伝子であり、少なくともいくつかのE2誘導後期遺伝子発現を調節することを示唆している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ゲノム編集による遺伝子改変ラットの作製がまだ行えていないため。
Strategy for Future Research Activity	ゲノム編集ツールの検討をさらに進め、エストロジェンの膜受容体GPR30欠失ラットを作製する。作製したラットの下垂体前葉初代培養細胞を用いて、エストロジェンによる増殖抑制作用に対する影響を調べる。さらに、増殖抑制作用に伴い発現変化する遺伝子を調べる。
Causes of Carryover	（理由）本研究の支出額の大部分を占める、遺伝子改変ラットの作製まで至らなかったため。（使用計画）遺伝子改変ラットの作製費用に用いる。その他、プラスミド、RNA抽出試薬、抗体など、消耗品の購入に使用する。