組織線維化に関与する新たな酸化シグナリングの解明と治療戦略への応用

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08552
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 勝山 真人 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (60315934)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 活性酸素 / NADPHオキシダーゼ / 組織線維化

Outline of Annual Research Achievements

組織線維化は不可逆的な変化であり、根治可能な薬物療法は現在のところ存在しない。NOX4は活性酸素種（ROS）を産生するNADPHオキシダーゼの触媒サブユニットの一分子種であり、NOX4が産生するROSは組織線維化に重要な役割を果たすが、その分子機構は未解明の点が多い。
申請者はNOX4 mRNAよりわずか4塩基だけ欠失したスプライスバリアント・NOX4A mRNAが肺由来線維芽細胞に発現し、NOX4Aが細胞内でROSを産生する可能性を見出した。C末端にMycタグを連結して培養細胞に発現させ、Mycタグに対するウエスタンブロットを行ったが、蛋白は検出されなかったことから、NOX4A mRNAは蛋白をコードしないものと考えられた。またH2O2検出用蛍光蛋白誘導体に核、ミトコンドリアへの移行シグナルを連結した発現ベクターと、NOX4A mRNA発現ベクターを細胞に導入し、蛍光顕微鏡を用いてH2O2産生の可視化を試みたが、NOX4A mRNA発現による明確なH2O2産生の増強は認められなかった。
一方申請者はNOX4のノックダウンにより、コラーゲンとエラスチンのクロスリンクに関与するリジルオキシダーゼ（LOX）がmRNAレベルで減少することを見出した。ヒトLOX mRNAの3’非翻訳領域を単離し、その全長および種々の欠失変異体をmiRNA効果検定用ルシフェラーゼベクターに挿入して肺由来線維芽細胞に導入し、NOX4に対するsiRNAにより発光量が減少する領域を同定した。しかし用いたsiRNAと一部が完全に相補的な配列だったことから、一連の現象がオフターゲット効果によるものであることが判明した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

用いた蛍光プローブとH2O2検出用蛍光蛋白誘導体の感度の問題もあると考えられるが、ROSの検出が思うように進まなかったことが理由のひとつである。
またこれまで観察していた現象が、siRNAのオフターゲット効果によるものであったことから、方針転換を余儀なくされたことが挙げられる。

Strategy for Future Research Activity

NOX4A mRNAは蛋白をコードしないlong non-coding RNAとして機能する可能性が高くなった。これまでNOX4A mRNA発現によるROS産生はパーオキシナイトライトとも反応するH2O2検出試薬でしか検出されていない。この現象がパーオキシナイトライトの産生を介する可能性を考え、他のROS産生酵素やNO産生酵素の発現誘導、あるいはROS消去系酵素の発現抑制を介するものかどうかを、定量PCRにより解析する。
NOX4由来ROSの標的蛋白の同定については、NOX4に対する別のsiRNAを用いた網羅的解析を行い、複数のsiRNAで再現性が得られる蛋白を新たに探索する。
一方、これまで用いてきたNOX4に対するsiRNAがLOXに対してもsiRNAとして作用することから、この標的配列を認識するmiRNAが組織線維化を抑制する可能性がある。そこでその発現変動とNOX4およびLOXの発現との相関を解析する。

Causes of Carryover

当初購入予定だったゲル撮影装置よりも安価で、機能面でも用途に耐えうるものを購入したため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

今年度の消耗品の購入に充当する。