血中短鎖脂肪酸濃度を決定付ける肝短鎖脂肪酸取込み調節機構の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08555
• Research Institution: Kyorin University
• Principal Investigator: 福冨 俊之 杏林大学, 医学部, 助教 (30439187)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木村 徹 杏林大学, 医学部, 学内講師 (30433725)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 短鎖脂肪酸 / トランスポーター / 酪酸 / プロピオン酸 / プロテオミクス / 質量分析 / 輸送体 / PDZ

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、血中短鎖脂肪酸の濃度を決定づける肝臓における短鎖脂肪酸の取り込み調節機構の解明を目指し、酪酸輸送体 organic anion transporter OAT7およびプロピオン酸輸送体OAT2の機能調節機構を明らかにすることを目的としている。
当該年度は、前年度に引き続き、OAT7の調節タンパク質候補分子の1つであるPDZK1に着目したPDZK1によるOAT7の酪酸輸送調節の解明とPDZK1以外のOAT7相互作用タンパク質の探索を行った。くわえて、プロピオン酸輸送体OAT2と相互作用するタンパク質の探索に着手した。
PDZK1によるOAT7の酪酸輸送調節の可能性を検討するため、前年度の成果を踏まて、ヒト肝臓由来細胞株を用いた生化学実験により、OAT7とPDZK1の相互作用を確認した。OAT7-PDZK1相互作用は、複数回の検証を通し、再現性の高い相互作用であることを明らかにした。くわえて、ヒト肝臓由来細胞において、細胞膜タンパク質のビオチン化と免疫沈降法を組み合わせた方法により、OAT7とPDZK1の相互作用が細胞膜上またはその近傍に存在することを明らかにした。
PDZK1以外のOAT7相互作用タンパク質の探索は、前年度に引き続き、プロテオミクスを用いた手法により実施した。ヒト肝臓由来細胞中より、免疫沈降法によりOAT7複合体を抽出し、その構成タンパク質を質量分析計を用いたプロテオミクス解析により、同定を行った。プロピオン酸輸送体OAT2の相互作用タンパク質の探索も上記の手法と同様に免疫沈降法とプロテオミクス解析を用いることにより、同定を行う。
以上より、当該年度において、OAT7とPDZK1の相互作用が細胞中においても、再現性の高い相互作用であることが明らかになった。くわえて、その相互作用は、膜上また膜近傍で検出されることが明らかになった。加えて、新たなOAT7相互作用タンパク質の候補タンパク質を見出した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究の進捗状況は、現在までに、概ね研究計画調書に則って進捗しているが、前年度に生じた、抗体を用いたOAT7検出とPDZK1遺伝子のノックダウンの条件検討の問題改善に時間を要した為、その影響が本年度へずれ込み、やや遅れが生じている。くわえて、本年度においても、shRNAを用いたPDZK1遺伝子のノックダウンの条件検討とOAT2の発現細胞の検討およびOAT2抗体の特異性に関しての問題によって、やや遅れが生じている。
OAT7抗体を用いたウェスタンブロットによるOAT7の検出において、複数の検出バンドが確認されたため、検出バンドは質量分析計により分析し、OAT7の検出バンドを同定することにより、問題点を改善した。加えて、前年度に引き続き、shRNAを用いたPDZK1遺伝子のノックダウンの条件検討を行った。これらの条件検討により、速やかな研究遂行が可能となったが、条件検討の遅れが、進捗状況の遅れにつながった。さらに、OAT2の抗体は、免疫沈降法やウェスタンブロットに用いるが、抗体の特異性に関する問題が生じている。その為、新たに抗体の反応条件等の検討および複数のOAT2抗体の性能確認の必要性が生じた。

Strategy for Future Research Activity

研究計画調書に則って、今後も研究を遂行する。しかし、前年度も当該年度も上述のように、研究の進捗状況にやや遅れが生じている。そのため、今後、研究分担者、連携研究者および研究協力者とより綿密な打ち合わせを行い、連携研究者および研究協力者の協力を仰ぎ、当初の研究計画の進捗予定に可能な限り合致させる。研究進捗に遅れを生じさせている問題を改善後、研究代表者がプロテオミクス解析によるOAT7およびOAT2の相互作用タンパク質の探索、研究分担者が生化学実験、研究協力者が輸送機実験をそれぞれが主として、同時並行して行うことにより、スムーズな研究遂行を目指す。

Causes of Carryover

前述の通り、OAT7抗体とOAT2抗体の特異性に関する問題およびshRNAを用いたPDZK1遺伝子のノックダウンの条件検討により、研究の進捗状況がやや遅延をしている。そのため、当該年度実施予定研究計画の一部が当該年度中に実施困難になり、次年度実施予定とした為、その必要使用額が次年度必要使用額として生じた。OAT7の輸送機能解析、OAT2相互作用タンパク質の探索および生化学実験による相互作用の検討が該当実験であり、その実験に必要不可欠な消耗品類に対する費用を必要使用額とし、次年度に使用を計画している。加えて、研究の遅延により、当該年度に計画していた研究成果発表が困難となった為、次年度へ計画を変更した。その計画変更に伴い、当該年度に使用を計画していた学会参加費および旅費等の必要使用予定額を次年度の使用額として計画している。