Functional analysis of methylated DNA-binding protein CIBZ in mouse embryogenesis

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08587
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 松田 永照 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教 (00335481)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: マウス初期胚発生 / ヘテロ接合体マウス / 胎生致死 / メチル化DNA結合タンパク質 / CIBZ / Cre-LoxP / ハプロ不全

Outline of Annual Research Achievements

DNAメチル化機構は、哺乳類の初期胚の発生に大きく変化することが知られている。DNAメチル化酵素のノックアウトマウスが胎生致死であることから、初期胚発生におけるDNAメチル化が正常な胎発生に必須であることが考えられる。DNAメチル化はメチル化酵素とメチル化されたDNAに結合するタンパク質（MBP）より構成されているため、MBPも胚発生に重要であると考えられる。ところが、既知のMBPをコードする遺伝子の欠損マウスでは初期胚の発生に異常が見られないため、我々が同定した新規DNAメチル化結合タンパク質であるCIBZ の機能解析を行った。Cre-loxPシステムを用いた条件付きベクターでCIBZのヘテロ接合体マウスの作製を試みたが、CIBZヘテロ接合体マウスが生まれていないため、CIBZハプロ不全による胎生致死であることが示唆された。
本研究では、CIBZヘテロ接合体マウスが胎生致死かどうかを検証し、CIBZ遺伝子のマウス初期胚の発生における役割を明らかにする。
今まで作製した条件付きマウス（flox-neo/+）ゲノム上に他の遺伝子の発現に著しい影響を与える可能性のneoカセットが存在するため、除去する必要がある。今回、このneoカセットを除去したマウス（flox/+）を作製した上で、CIBZヘテロ接合体マウスの作製を試みた。その結果、出生マウスの中にはCIBZヘテロ接合体マウスが存在しなかったことから、CIBZハプロ不全による胎生致死であることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今まで作製したCIBZのflox-neo/+ マウスゲノム上のneoカセットが標的遺伝子や隣接する他の遺伝子の発現に影響をおよぼす可能性があるため、除去する必要がある。このカセットを除去するため、CIBZのflox-neo/+ マウスとFｌpを発現するトランスジェニックマウスとの交配により、CIBZのflox/+ マウスの作製に成功した。
CIBZハプロ不全による胎生致死を検証するため、CIBZのflox/+ マウスとCre を全身発現するマウスと交配させ、CIBZヘテロ接合体 (△flox/+) マウスの有無を検証した。その結果出生マウスの中にはCIBZヘテロ接合体マウスが存在しなかった。
胎仔死亡の時期を調べるため、CIBZのflox/+ マウスとCreマウスとの交配によって妊娠したマウスより各時期の胚を取り出して検証し。その結果、CIBZヘテロ接合体 (△flox/+) 胎仔はE11.5以降では存在しないことが明らかとなった。

Strategy for Future Research Activity

CIBZヘテロマウスにより胎仔死亡の時期と原因を明らかにするため、CIBZのflox/+ マウスとCreマウスとの交配の匹数を増やして、CIBZハプロ不全による胎仔死亡の時期（E6.5～E10.5）と原因を特定する。
胚発生ステージにおけるCIBZの発現と部位を明らかにする。

Causes of Carryover

Cre-ER（CAGG Cre-ERTM 、Jackson Lab）マウスと抗体の発注はしていないため

Expenditure Plan for Carryover Budget

CIBZの欠損が心筋などに影響を与えるかどうかを検証するため、CIBZのflox/+ マウスとCre-ERマウスの交配させる。