Functional analysis of methylated DNA-binding protein CIBZ in mouse embryogenesis

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08587
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 松田 永照 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (00335481)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 胎生致死 / DNAメチル化 / メチル化DNA結合タンパク質 / 胚発生 / 転写因子 / ES細胞 / Cre-loxPシステム

Outline of Annual Research Achievements

哺乳類のDNAメチル化は遺伝子の発現調節を介して、様々な細胞の発生や分化に重要な役割を果たしていることが知られている。DNAメチル化機構はメチル化酵素とメチル化されたDNAに結合するタンパク質（MBP）より構成されている。DNAメチル化酵素はマウス初期胚の発生に必要であることから、MBPも胚発生に重要であることが考えられる。しかし、既知のMBPをコードする遺伝子の欠損マウスは初期胚の発生に顕著な異常をきたすという報告がないため、胚発生におけるMBPの役割が不明である。
我々が同定した新規MBPであるCIBZがマウス胚発生に影響を与えるかどうかを調べるため、Cre-loxPシステムを用いた条件付きマウス（flox-neo/+）よりCIBZのヘテロ接合体（CIBZ欠損）マウスを作成した。その結果、他の遺伝型の同腹仔と比較して、CIBZ欠損胎仔は胎生6.5日目（E6.5）から小さくなりはじめ、E9.5では存在しないことから、CIBZはマウス胚発生に必須であることが分かった。また、CIBZ欠損胎仔は細胞増殖に異常がないが、細胞死が亢進していることが観察された。さらに、CIBZが着床前のE3.5（胚盤胞）の発生に影響を与えるかどうかを検証するため、胚盤胞をin vitroで培養して発生の状況を調べた。その結果、CIBZを欠損した胚盤胞が野生型より発生能が顕著に低下したことから、CIBZが胚盤胞の発生に重要であることが分かった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CIBZ欠損胎仔の死亡時期、異常と死亡原因を概ね明らかにされた。
CIBZがマウス胚盤胞の発生に影響を与えるかどうかを検証するため、in vitroで培養した胚盤胞の発生能を経時的に調べた結果、CIBZを欠損した胚盤胞の発生能が野生型より有意に低下した。
免疫蛍光染色の結果から、CIBZ は未受精卵、受精卵と２細胞期胚で高く発現しているが、４細胞期胚からその発現が顕著に低下していることが分かった。また、野生型のC57BL/6マウスとCIBZのfl/+マウスの胚盤胞からそれぞれのES細胞株を複数樹立した。

Strategy for Future Research Activity

CIBZ欠損マウスにより胎仔の異常の原因をさらに明らかにするため、着床前の胚盤胞と着床後のE6.5の胎仔の細胞増殖と細胞死などを詳しく調べる。
CIBZの△fl/+ ES細胞株及び△fl/△fl ES細胞株を樹立する。
野生型のES細胞、△fl/+ ES細胞と△fl/△fl ES細胞を通常の培養条件下と分化培養条件下において、細胞増殖と細胞死などに違いがあるかどうか、関連遺伝子の変化などを検証する。

Causes of Carryover

CIBZに関するマウスの実験に予想以上に時間がかかった。また、当初計画していなかったマウスの胚盤胞の採集と分化誘導法の樹立を行う必要があり、研究遂行に時間を要した為、次年度使用額が生じた。
使用計画としては、CIBZの欠損が：(1)着床前後の胚発生に与える影響、(2)ES細胞の増殖・分化と細胞死に与える影響、を解析するための物品購入費用とする予定である。