運動効果におけるリポ蛋白リパーゼの作用：ノックアウトウサギを用いた研究

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08607
• Research Institution: Akita University
• Principal Investigator: 西島 和俊 秋田大学, バイオサイエンス教育・研究サポートセンター, 准教授 (70435874)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西田 裕一郎 佐賀大学, 医学部, 講師 (50530185) ; 新見 学 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (80644898)
• Project Period (FY): 2016-10-21 – 2019-03-31
• Keywords: ノックアウトウサギ / 脂質代謝異常 / 運動効果

Outline of Annual Research Achievements

前年度に引き続き、CRISPR/Cas9システムを用いたノックアウトウサギ作製実験を行った。ウサギリポ蛋白リパーゼに対するガイドRNAとCas9ヌクレアーゼRNAをマイクロマニュピレーターにより、受精卵細胞質内にマイクロインジェクションした。116個の受精卵にマイクロインジェクションし、仮親雌の卵管内に胚移植したところ、6匹の産子しか得られず（約5％）、極端に効率が悪かった。また、得られた6匹の産子の内3匹は死産で、残りの3匹の内2匹は生後1週間程で死亡した。この原因として、マイクロインジェクション処置が受精卵に大きなダメージを与えた可能性や、注入したRNA溶液が受精卵に毒性を示した可能性、リポ蛋白リパーゼの欠損が個体の発生・成長に悪影響を与えた可能性が考えられた。得られた産子の内の残りの1匹は、離乳し、成体となった。血中のトリグリセリドを計測したところ、対照ウサギでは120 mg/dLであったのに対し、当該個体では、＞500 mg/dLという結果であった。リポ蛋白リパーゼは、カイロミクロンや超低比重リポ蛋白中のトリグリセリドを加水分解する酵素であり、ヘテロ欠損であっても高トリグリセリド血症を示すことが知られているため、当該個体は一方のアレルのリポ蛋白リパーゼ遺伝子のみが変異したヘテロ個体である可能性が考えられた。現在、遺伝子のシークエンスを行っている。当該個体はメスであったため、F1世代を得るために、雄ウサギと交配する必要がある。繁殖において十分成熟したと考えられる6月齢になるのを待って、雄ウサギ精子を人工授精し、現在までに妊娠兆候を確認している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

CRISPR/Cas9コンストラクト注入後の受精卵から得られる産子の割合が極端に低く、また産子がえられても、離乳前に死亡することから、ファウンダーウサギを得るまでに多くの時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

現在生存する１匹について、引き続き、繁殖を行って次世代コロニーを確立し、その個体を用いた特性解析を実施する。また、この個体の遺伝子変異がモザイクである可能性もあるため、引き続きファウンダーウサギの作製実験を行う。これまでの結果では、受精卵細胞質内にマイクロインジェクションした場合に、得られる産子が極端に少なかったため、今後はエレクトロポレーションによる遺伝子導入を行い、受精卵への傷害の軽減、作業の効率化を図る。

Causes of Carryover

リポ蛋白リパーゼノックアウトウサギの作製行程に遅れが生じ、予定していた特性解析にも遅れが生じた。次年度以降に、特性解析に必要な費用の使用が見込まれ、また、特性解析に必要なリポ蛋白リパーゼノックアウトウサギ、対照となるヒトリポ蛋白リパーゼトランスジェニックウサギの飼育経費が必要となる。

Research Products

• [Presentation] Effect of inhibin antiserum administration and vulva color on superovulation in rabbit. (2017)
  • Author(s): Nishijima K, Watanabe G, Kitajima S, Basaki K, Fukuda Y, Komatsu Y, Yano M, Obata T, Matsuo Y, Matsuda Y, Seki S.
  • Organizer: 7th International Congress on Rabbit Biotechnology
  • Int'l Joint Research