2017 Fiscal Year Research-status Report
Mafa欠損MIN6細胞をもちいた膵β細胞の成熟機構の解析
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16K08622
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
宮崎 早月 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (60452439)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Mafa / インスリン / 膵ベータ細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖尿病の病因を解明するためには、膵ベータ細胞の持つインスリン分泌制御メカニズムをより深く解析する必要がある。本研究では、膵ベータ細胞の発生や成熟、インスリン分泌能、糖尿病の発症や進行に深く関わる転写因子Mafaを膵ベータ細胞特異的に欠損させ、この遺伝子がベータ細胞の分化成熟の過程や機能維持においてどのような役割を果たしているかを詳細に検討することを目的としている。
MafaノックアウトIT-6マウスから樹立したMafaノックアウトベータ細胞株（MIN6-Mafa-KO細胞）は、オリジナルのMIN6細胞と比べ、細胞の大きさが小さく、グルコース応答性インスリン分泌能が著しく低下していることから、未成熟な性質を有している可能性が示唆された。そこで、分化成熟、機能維持における役割を検討するため、Mafaを発現するアデノウイルスベクターやレンチウイルスベクターを感染させ、短期過剰発現rescue細胞と長期過剰発現rescue細胞を作製した。今年度は、それらの細胞におけるグルコースなどに対するインスリン分泌能の変化や、増殖・アポトーシスへの影響、電子顕微鏡によるインスリン分泌顆粒の変化など、詳細な機能解析を行った。
一方でMafaによるmRNA発現の変化をDNAマイクロアレイなどを用いて解析した。短期過剰発現rescue細胞と長期過剰発現rescue細胞の２群において共通に変動している遺伝子群や、一方のみで変動している遺伝子群がそれぞれ多数得られた。今後は、このDNAマイクロアレイの結果をもとに、MIN6細胞のRNA seqのデータと比較し、Mafa ChIP sequenceのデータと組み合わせ、Mafaによるベータ細胞の成熟や機能維持に深く関係する遺伝子を探索する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度に作製した短期過剰発現rescue細胞（MIN6-AdV-Mafa細胞）とコントロール細胞（MIN6-AdV-EGFP細胞）、長期過剰発現rescue細胞（MIN6-LentiV-Mafa細胞）とコントロール細胞（MIN6-LentiV-EGFP細胞）をそれぞれ用いて機能解析を行った。AdVを感染させた細胞は感染後３～４日以内に必要な実験を行った。Lenti-Vを感染させた細胞は約３週間puromycinで薬剤選択を行ったのちに、実験に使用した。MIN6-AdV-Mafa細胞とMIN6-LentiV-Mafa細胞におけるMafaの発現を免疫染色やqPCR、ウエスタンブロットにて確認した。これらの細胞をもちいて、グルコースなどの刺激に対するインスリン分泌能をELISAにて検討した。さらに、増殖やアポトーシスへの影響を調べた。また、電子顕微鏡にてインスリン分泌顆粒の状態を観察した。その結果、Mafa発現により、グルコースやKClなどに対するインスリン分泌反応が大きく改善していることが確認された。またMafa発現により、増殖能が増加し、apoptosisも低下していた。インスリン分泌顆粒については、Mafa KO細胞ではインスリン分泌顆粒の数も少なく、顆粒の密度も明らかに低い傾向があったが、Mafa発現によりこれらが改善していた。
一方で、DNAマイクロアレイも行い、短期過剰発現rescue細胞と長期過剰発現rescue細胞の２群において共通に変動している遺伝子群や一方のみで変動している遺伝子群をそれぞれ抽出した。今年度予定していた実験は順調に進展した。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNAマイクロアレイやMafa ChIP sequenceなどのデータをもとに、短期過剰発現rescue細胞と長期過剰発現rescue細胞の２群において共通に変動している遺伝子群の中で、特に顕著に発現の増加している遺伝子を選び、その中から、インスリン分泌制御に関わる可能性のある５遺伝子を選び、それらの発現ユニットを作成し、レンチウイルスベクターに組み込む。これらをMIN6-Mafa-KO細胞に導入し、グルコース応答性インスリン分泌など、ベータ細胞機能がどの程度改善するかを検討する。この結果により、Mafaによるベータ細胞の成熟において機能的に働いている遺伝子を確定する。
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