2016 Fiscal Year Research-status Report

日本人におけるEGFR遺伝子変異型肺がんリスクに関連する遺伝子の解明

Research Project

Project/Area Number	16K08640
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	高橋めい子 (児玉めい子) 京都大学, 医学研究科, 特定講師 (20372592)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	EGFR変異 / 肺がん / GWAS / SNP / MiSeq
Outline of Annual Research Achievements	本課題では日本人におけるEGFR遺伝子変異型肺がんリスクに関連する遺伝子の解明を目的とし、MiSeq次世代シーケンサーを用いてEGFRの突然変異の有無を高速に解析する新しいプロトコールを確立する。EGFR 遺伝子変異はチロシンキナーゼドメインに集中しているが、特に頻度が高いものはエクソン19の欠失変異と、エクソン 21の点突然変異 L858Rである。しかしながら、まれな点突然変異等もエクソン18と20に少数認められるため、当初予定していたエクソン19と21に加えて18と20もシーケンス対象とし、シーケンスライブラリをローコストで作製可能なプロトコールを作った。 MiSeqランにはIllumina社のキットを使用するがプロトコール通りに実施すると莫大な費用を要することになるため、1ランあたり768サンプルのシーケンスができるような条件検討を開始した。サンプル調製では、まずターゲット領域の両側にシーケンスを行うためのアダプターとサンプルを識別するためのバーコード配列を結合させる。そこで上記領域を増幅するプライマーの末尾にアダプターが結合可能な共通配列をオーバーハングで持たせ、それぞれをTailed PCRすることでオーバーハング領域を付加した。PCRはマルチプレックスPCR法を用いて1反応液内で各エクソンを同時に増幅させることに成功した。また、反応液を標準プロトコールの約1/3の系に縮小したことによって試薬コストの削減を行うことができた。384サンプル分のバーコード配列はillumina社より購入し、アダプターとバーコード配列の付加はillumina社のキットを使用しPCRによって付加した。残りの384サンプル分は申請者らが開発したバーコードを付加することに成功した。バーコード付加に関しても反応液を1/4に縮小してコスト削減を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason コスト削減のためマルチプレックスPCR法を実施することにしたため、各エクソンの増幅効率を合わせるのに時間を要したが、おおむね順調に進展している。
Strategy for Future Research Activity	バーコードが付加された768サンプルは精製後混合し、MiSeqを用いてシーケンスする。申請者らが実施した日本人集団の肺がん患者検体と対照群検体のGWAS結果を用いて、現在までに報告のない日本人におけるEGFR遺伝子変異の有無を考慮した関連解析、さらに肺がんの組織型・喫煙状況・性別など臨床病理学的因子との相関関係を統計学的に解析する。本課題が成功しEGFR遺伝子変異型肺がんリスク感受性遺伝子の全貌を明らかにすることで、人種間や病態・環境因子・生活習慣における相対的貢献度を解明することが可能になる。また、新たな分子診断や予後の予測、新薬の開発等につながれば社会的に大きな貢献も期待できる。
Causes of Carryover	前年度計画ではEGFR遺伝子のエクソン19と21のみシーケンス予定だったが、まれな点突然変異等の見落としをなくすため、当初計画に加えエクソン18と20も同時にシーケンスすることにした。またマルチプレックスPCR法を実施することでコスト削減を図ったが、プライマー末端に共通配列をオーバーハングで持たせているため、増幅が認められないターゲットやエクストラバンドの発生が確認され条件検討に想定以上に時間を要した。前年度の物品費に未使用額が生じた主な原因は、高額な試薬を要するMiSeqのランまで至らなかった事と、ライブラリ作製の条件検討等は研究室のキット・試薬を使用することができたためである。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度の研究費と合わせた使用計画としては、すでにMiSeqランの準備は整っているのでそのための試薬を購入する予定である。