ヒト疾患モデルマーモセットを用いたゲノム編集による遺伝子修復治療技術の確立

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08642
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 三谷 幸之介 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (10270901)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 遺伝子治療 / ゲノム編集 / 免疫不全症 / ウイルスベクター / 疾患モデルマーモセット

Outline of Annual Research Achievements

「目的１：ゲノム編集の効率化」
遺伝子修復の効率を上げる方法として、1) CRISPR-Cas9 の効率の良い発現と、2) 修復の鋳型DNA の効率の良い導入の２点から検討した。SpCas9タンパク質とヒトもしくはマーモセットのIL2RGもしくはHPRT遺伝子座を標的としたガイドRNA（gRNA）とを発現する方法として、Cas9 mRNA + gRNA、RNP（Cas9タンパク質とgRNAとの複合体）、プラスミドDNA、E1欠損型アデノウイルスベクターDNA、ヘルパー依存型アデノウイするベクターDNAならびに アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターDNAを構築した。また、それぞれの遺伝子座にマーカ－遺伝子をゲノム編集で組み込みためのドナーDNAをコードした、プラスミドDNA、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターDNAならびに AAVベクターDNAを構築した。

「目的２：ゲノム編集の安全化」
遺伝子修復の安全性を高める方法として、1) 人工制限酵素の活性を制御してオフターゲット切断を減少させる方法と、2) shRNAを利用したネガティブ選択法によって修復用ドナーDNA のランダムな部位への組込みを除く方法とを検討している。Cas9 の活性を厳密に制御するために、合成抗菌剤トリメトプリム（TMP）の添加によって蛋白質の安定を制御できる大腸菌DHFR 遺伝子断片をCas9に融合した制御可能Cas9（ddCas9）遺伝子を作製した。また、このタンパク質が発現することを、培養細胞でウエスタンブロット法によって確認した。shRNA を利用した新規のネガティブ選択法については、既に候補としているRRP-12遺伝子に対する何種類かのshRNA発現カセットを搭載したAAVベクターを構築した。ヒトiPS細胞で実験を行ったが、用いたAAVの血清型では遺伝子発現効率が低いため、他の血清型をスクリーニングした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

「目的１：ゲノム編集の効率化」
CRISPRを発現する様々なウイルスベクターなどのプラスミドDNAは完成し、一部はDNAレベルで血液系の培養細胞（K562）で活性を検討した。ウイルスまで産生するという当初の予定通りには行かなかったが、その一方で、多様なドナー用ベクターDNAも構築した。それに加えて、ゲノム編集を蛍光の発光で安易に測定できる293細胞とK562細胞を樹立出来た。これらの点から、当初とは予定が違うが十分の進捗は得られたと考える。また、現在入手可能な唯一のマーモセット由来細胞株であるマーモセットのES細胞を理研細胞バンクより入手した（初代細胞は、線維芽細胞を実中研より入手済み）。しかし、この細胞の培養はフィーダー細胞が必要であり、遺伝子導入を妨げる。しかし、工夫することによって３継代はフィーダー細胞なしで培養出来たので、今後その方法で遺伝子導入・ゲノム編集法を検討する予定である。この点は、予期しなかった問題を上手く解決出来たと考える。

「目的２：ゲノム編集の安全化」
私達は既にヒトES/iPS 細胞の増殖に関与するRRP-12遺伝子を標的としたshRNA を用いたネガティブ選択が有用であることを示した。これらをコードするHPRT標的AAVベクターを産生したが、上記のように血清型が至適ではなかった。そこで様々な血清型をスクリーニングし直して、DJと呼ばれる血清型が非常に高い効率でヒトiPS細胞に遺伝子を導入することを見出した。一方、このshRNAが血液細胞で働くかについてはまだ検証出来ておらず、今後の課題である。

Strategy for Future Research Activity

「目的１：ゲノム編集の効率化」
既に、CRISPR発現ベクターDNAと修復用ドナーDNAをコードした各種ベクターDNAは構築した。これらのDNAからウイルスを産生し、K562細胞とヒト造血幹前駆細胞とを用いて、最も高い効率でゲノム編集を達成可能なベクター系を決定する。具体的には、HPRT 遺伝子座を標的とする場合には、6TG 耐性（HPRTノックアウト）細胞の出現頻度などを指標にして至適なゲノム編集効率を検討する。また、IL2RGを標的にする場合には、Venus等の蛍光遺伝子のノックインの頻度をFACSで測定することによって、至適な発現法を確認する。さらに、マーモセットの造血幹前駆細胞で実験をする前に、共同研究先の実中研で作られたIL2RG遺伝子 exon 2 ノックアウトマーモセットと同様の欠失変異を持ったヒトK562細胞とhiPS細胞を樹立して、色々なアッセイを容易に行う。

「目的２：ゲノム編集の安全化」
RRP-12遺伝子を標的としたshRNA を用いたネガティブ選択法について、造血細胞に至適な6型のAAVベクターとヒトiPS細胞に至適なDJ型のAAVを産生して、それぞれの細胞でRRP-12 や他の標的遺伝子に対するshRNA がどれくらい有効化を検討する。一方、HPRT遺伝子座を標的としたddCas9を用いて、TMP の存在・非存在下で遺伝子修復の効率を比較する。さらに、GUIDE-seq 法によって通常のCas9 とddCas9 を用いた場合の変異導入頻度の違いを、予測オフターゲットサイトのdeep sequence によって検討し、ddCas9 法の有効性を検証する。　最終的には「目的１」と「目的２」との成果を組み合わせた上で、マーモセットの造血幹前駆細胞における遺伝子修復の効率と安全性とを検討する。