2016 Fiscal Year Research-status Report
骨カップリング因子Cthrc1の骨形成促進機構の解明と創薬への応用
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16K08681
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| Research Institution | National Center for Geriatrics and Gerontology |
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Principal Investigator |
竹下 淳 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, 運動器疾患研究部, 研究室長 (50263009)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 骨代謝 / カップリング因子 / Cthrc1 / 受容体 / 骨形成 / 骨芽細胞分化 / Waif1 / Wnt |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Cthrc1による骨芽細胞分化促進に関わるシグナル伝達機構を解明するためにCrispr-CAS9法を用いてWaif1欠損ST2細胞を樹立した。また、２日齢のWaif1 sKOマウスの頭頂骨から骨芽細胞株を樹立した。
ST2細胞をCthrc1で刺激するとPKCδ、ERK、Rac1、及びJNKが活性化し、ALP活性を指標とした骨芽細胞分化はWaif1の欠損により消失するだけではなく、PKCδ、及びERKの阻害剤により濃度依存的に阻害されたが、PLCとJNKの阻害剤では抑制されないことから、Cthrc1はWaif1を介してERK／PKCδ／Rac1を介して骨芽細胞分化を促進することがわかった。
Osx-creマウスを用いた骨芽細胞特異的Waif1 cKOマウスの脛骨をマイクロCTにより解析するとWaif1 cKOマウスは高骨量であることがわかった。さらに、組織学的骨形態計測の結果、骨吸収と骨形成の両方が低下した低骨代謝回転型高骨量を発症することが判明した。血清中の骨代謝マーカーを測定したところ、骨形成マーカーや骨吸収マーカー及び骨吸収に関連するOPGやRANKLにはcKOマウスと野生型マウスとでは差異は認められなかったが、Wntの阻害因子であるスクレロスチンは野生型に比べcKOマウスで約20%高値を示したことからWaif1欠損によりWntの制御に異常が起きた可能性が示唆された。
Waif1を介したCthrc1刺激をミミックするモノクローナル抗体を作成するために可溶性sWaif1-Hisタンパクを精製し、Waif1 sKOマウスに免疫し、常法に従いハイブリドーマを作成した。sWaif1-Hisを用いてELISA法、及びFACSを用いてスクリーニングしたものを限界希釈培養し、培養上清をST2細胞に添加しALP活性を指標にして骨芽細胞分化を促進するモノクローナル抗体を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
マウスを用いた遺伝学的解析により破骨細胞が産生・分泌するCthrc1は骨芽細胞分化を刺激し骨形成を促進することがわかった。そこで、骨粗鬆症をターゲットとした新薬開発のためにCthrc1の刺激をミミックする骨形成促進薬の開発を目指している。
Cthrc1の受容体の候補としてWaif1を同定し、生化学の手法を用いて両者が直接結合すること、Waif1欠損によりCthrc1によるALP活性の上昇が抑制され、PKCδやERKの活性化も消失することからCthrc1はWaif1を介してPKCδ/ERK経路を活性化することで骨芽細胞分化を誘導し、骨カップリング機能を発揮することが判明した。
Cthrc1刺激をミミックする化合物や抗体を検索するためにスクリーニングの材料としてWaif1欠損細胞株を樹立することに成功した。これらの細胞株を用いてまずは抗体薬の取得から着手した。得られたモノクローナル抗体のスクリーニングでは抗原として用いたリコンビナントsWaif1-Hisのみならず、FACSではWaif1欠損株と過剰発現細胞株を用いてWaif1の立体構造を認識する抗体取得し、さらにST2細胞のALP活性を指標に抗体刺激により骨芽細胞分化を促進するものをスクリーニングすることが可能となり、現在ALP活性を指標とした抗体のスクリーニングを行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Cthrc1刺激をミミックし骨形成を促進するものを同定するためにCthrc1の受容体であるWaif1に結合しALP活性を促進するモノクローナル抗体をスクリーニングし、それらの中からPKCδ/ERKを活性化し骨芽細胞分化を促進するモノクローナル抗体をスクリーニングする。また、精製抗体をマウスに投与し骨解析により骨形成を促進するかどうかを検討する。
Waif1欠損が加齢したマウスにどのような影響をあたえるかを解析するためにWaif1 cKOマウスを長期飼育し、骨解析を行う。また、RANKL投与によるカップリング機能の評価系を用いてWaif1 cKOマウスのカップリング機能を解析する。
Waif1欠損による低骨代謝回転型高骨量の原因を解明するためにWaif1欠損による骨吸収低下の原因を解析する。
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| Causes of Carryover |
昨年度中に発注した消耗品が年度内に納品されなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
昨年度発注した消耗品が今年度に納品される予定。
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