2016 Fiscal Year Research-status Report
miRNAノックダウン住血吸虫を用いた細胞外小胞における性成熟への機能解析
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16K08756
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
熊谷 貴 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (40369054)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 住血吸虫 / miRNA / miR-Bantam / レンチウイルス / Tough Decoy |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度の目的の一つは、日本住血吸虫のmiRNA（miR-SjBantam)を標的としたノックダウンシステムの開発である。今回、miRNAの機能・発現を阻害する”Tough Decoy miRNA blocking system"を採用した。この方法は、標的となるmiRNAに結合可能だが機能を競合する配列を人工的に作成し、細胞内で発現させることで、標的となるmiRNAの機能を阻害し恒常的なノックダウン状態にする方法である。今回、この方法を導入するにあたり、以下の作業を行った。１）日本住血吸虫の小分子RNA発現用プロモーター領域（U6プロモーター）の同定、２）miR-SjBantamを標的としたTough Decoy miRNAの設計と作成、３）作成した遺伝子領域のレンチウイルスへの挿入とウイルス作成。
当該年度の成果としては、初めに導入するTough Decoy miRNAを発現させるためのプロモーターを導入することが必要であり、そのために既知のマンソン住血吸虫のU6プロモーター配列を元に日本住血吸虫での該当配列をデータベースから見つけた。この配列をベクター中にクローニングを行なった。次に、miR-SjBantamの配列を元にTough Decoy配列を設計し、これをプライマー伸長法により合成し、PCRで増幅した該当配列をベクターにクローニングした。これらの２つのベクターの挿入配列を結合させ、レンチウイルスベクターに挿入することで完成させた。このベクターは293T細胞に導入し、上清よりレンチウイルスを回収した。ウイルス力価はリアルタイムPCR法により測定し、十分量のウイルスが回収できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は本研究課題の準備段階としての、miRNAノックダウンのためのツールの開発がメインであった。今回、その一つであるmiR-SjBantamに対するTough Decoy配列を有するレンチウイルスを作成できたのは、本目的の一つの到達点であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は作成したレンチウイルスを用いて、実際に日本住血吸虫の幼虫にウイルスを感染させ、遺伝子導入についての検討を行う。まず、培養下において、日本住血吸虫の幼虫に作成したTough Decoy miRNAを含んだレンチウイルスを感染させ、ゲノムへの遺伝子導入、導入遺伝子の発現確認を行う。その後、実際に標的となるmiRNAの発現調整への関与、miRNAの標的となる既知遺伝子の発現変動についての確認を行い、どのような形態変化が起こるのかや、同時に性成熟・産卵への影響について観察を行う。また、同時に、幼虫だけではなく、成虫への遺伝子導入も行い、ペアリングへの影響やmiRNAの発現状況についても同様の確認を行う。また、これまで調べられていない虫卵やその中の幼虫についても同様の検討を行い、多角的なアプローチによってmiRNAの機能について検討を行う予定である。
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