2017 Fiscal Year Research-status Report
赤痢アメーバに特異的な脂質を介した選択的輸送システムの解明
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16K08768
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
中野 由美子 (斉藤由美子) 国立感染症研究所, 寄生動物部, 主任研究官 (30321764)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Rab GTPase / Cdc50 / Entamoeba histolytica |
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| Outline of Annual Research Achievements |
赤痢アメーバの表面タンパク質の輸送には、膜融合の分子スイッチであるRab8A GTPaseに依存した経路と非依存的な経路がある。EhRabA8依存的に輸送される表面タンパク質のうち、前年度では酵母Cdc50のホモログEhCdc50を結合タンパク質として単離した。EhCdc50の特徴として、ヒトや植物のCdc50との相同性がアミノ酸レベルで33-36％を示しさらに、植物のCdc50ホモログ（ALIS5)は酵母の低温感受性を相補するのに対して、EhCdc50は酵母のcdc50欠失変異の低温感受性を相補できなかった。また、EhCdc50は、細胞表面に提示される中央部分に、３カ所の糖鎖修飾を受けることが、糖転移酵素の阻害剤を用いて分かった。そもそも赤痢アメーバの糖鎖修飾酵素は、他種生物に比べて数が縮小しており、糖鎖修飾を受ける分泌タンパク質としてはシステインプロテアーゼや細胞表面レクチンに続く報告となる。他種生物ではCdc50はゲノムに3個から5個ホモログが存在しており、個々のホモログの局在は、トランスゴルジネットワーク、エンドソーム、細胞膜と局在が分かれている。赤痢アメーバのCdc50はゲノムに１つしか存在しないため、Cdc50の細胞表面ドメインを認識するポリクローナル抗体を作製し、定常状態でのEhCdc50の局在を観察した。その結果EhCdc50は細胞膜に局在することが分かった。赤痢アメーバのゲノムにはCdc50と結合すると考えられるP4-type ATPaseが11個存在するため、細胞質に局在するATPaseはEhCdc50依存的に、またエンドソーム／TGNに局在するATPaseはEhCdc50非依存的に輸送されると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
他種生物とは全く異なり、赤痢アメーバのCdc50が小胞体からRab8A GTPaseによって輸送されること、またEhCdc50の特徴を明らかにした。EhCdc50を大量発現させて小胞体にとどまらせても貪食や細胞接着に変化を示さなかったため、EhRab8によって輸送される接着に必要なタンパク質はEhCdc50ではないと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
EhRab8によって輸送される接着に必要なタンパク質を同定するため、最終年度は細胞表面全体のタンパク質をビオチン化し、野生型とEhRab8機能欠損の株のプロファイルを比較することにより、EhRab8によって輸送される積み荷タンパク質のより網羅的な同定を試みる。基礎的な実験条は既に確認済みであり、候補タンパク質のクローン化と形質転換アメーバ株の作製に既に着手している。
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| Causes of Carryover |
Rab8A依存的に輸送されるタンパク質を同定するために、細胞表面をビオチン化し、Rab8A発現抑制株特異的に細胞表面への提示が低下するタンパク質の同定を２年目に行う予定であった。細胞表面のビオチン化の条件は整いつつ有り、最終年度に余剰金を使用してビオチンタンパク質の質量解析を行う予定である。
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