2017 Fiscal Year Research-status Report
黄色ブドウ球菌新規TAシステムによるDNAトポロジー制御機構に関する研究
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16K08776
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
加藤 文紀 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 助教 (70452589)
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| Project Period (FY) |
2016-10-21 – 2020-03-31
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| Keywords | 黄色ブドウ球菌 / トキシン・アンチトキシンシステム / DNAジャイレース |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌のトキシン・アンチトキシン(TA: Toxin-Antitoxin)は、細胞死、ストレス応答、病原性因子発現制御、薬剤抵抗性であるパーシスター形成において注目されている機構である。黄色ブドウ球菌で新規に見出したTAシステム(StrAB)の機能解析を目的として研究を行った。大腸菌を用いた予備実験より、トキシンはDNAトポロジー変化を誘発することから、DNAに負の超螺旋構造を導入する酵素であるDNAトポイソメラーゼの１種DNAジャイレース阻害が想定された。DNAジャイレースは真核生物には存在せず。細菌のみが保有する酵素であることから、キノロン系抗菌薬の標的として知られている。
当該年度は、トキシンであるStrBの機能を解明するために、１）大腸菌でトキシンタンパク質を発現・精製し、in vitroにおけるDNAジャイレース阻害活性を解析した。これまでHIsタグを用いたタンパク質精製及びHisタグ切断により、安定的な構造を保持するタンパク質として精製することが困難であった。可溶化タグであるProS2を融合させることで、活性を保持した状態でStrBを精製することに成功し、大腸菌及び黄色ブドウ球菌DNAジャイレースの酵素活性をin vitro実験で阻害することを明らかにした。この結果から、StrBトキシンは、DNAトポイソメラーゼの１種であるDNAジャイレースの酵素活性を阻害することを証明した。グラム陽性細菌におけるDNAジャイレースを阻害するトキシンは初めての知見である。
２）ブドウ球菌属の７菌種に由来するトキシン活性の異なるオーソログ間でアミノ酸配列比較し、StrBのトキシン活性に重要なアミノ酸残基をアミノ酸変異導入実験により、昨年度の結果に加え、新たに３７番目のアミノ酸も重要であることを明らかにした。当該年度は当初の予定通り順調に進展している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初、大腸菌でHisタグを融合させたタンパク質として発現・精製したStrBはin vitroにおけるDNAジャイレース阻害実験において、阻害活性を有していなかった。NMR解析から、安定的な構造を保持していないことが明らかとなり、可溶化タグとして知られているProS2タグを導入することで、活性を保持したStrBを精製することに成功し、大腸菌及び黄色ブドウ球菌のDNAジャイレースを阻害することを明らかとした。この結果により、予備実験により想定されたDNAトポロジー制御機構として、DNAトポイソメラーぜの１種であるDNAジャイレースの活性を阻害することを明らかにした。グラム陽性菌においてDNAジャイレースを阻害するトキシンは初めての知見である。
また、昨年度に続きStrBのトキシン活性に重要なアミノ酸残基をオーソログ間におけるアミノ酸配列比較及びアミノ酸置換実験から、３７番目のアスパラ酸残基がトキシン活性に重要であることを新たに明らかにした。
黄色ブドウ球菌における生物学的な役割を明らかにするための、MRSA株であるN315株を用いて遺伝子欠損株を取得した。取得した遺伝子欠損株を用いて薬剤感受性への影響を解析している。
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| Strategy for Future Research Activity |
生物においてDNAトポロジーの変化はDNAの複製・修復・転写・組み換え等の様々な機能制御に大きく関係している。また、細菌のTAシステムは、ストレス環境下での応答、薬剤感受性や病原性の制御などに関与することが報告されており、本研究のDNAジャイレースを標的とするTAシステムが黄色ブドウ球菌においてどのような生物学的な作用を有するのかは非常に興味がある。そこで、取得した遺伝子欠損株及び現在作製中の遺伝子過剰発現株を用いて、薬剤感受性、病原性、遺伝子発現の変化を解析する。
DNAジャイレースはキノロン系抗菌薬の標的酵素として知られており、AサブユニットとBサブユニットからなる酵素である。そこで当該年度は、トキシンによるDNAジャイレース阻害作用を詳細に解明するために、１）DNAジャイレースのAまたはB、どちらのサブユニットに作用するのか、２）DNAジャイレースの酵素反応のどのステップを阻害するのか、３）トキシンが作用するDNAジャイレースのアミノ酸残基の同定を行う。
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| Causes of Carryover |
実験が順調に進んだため、当初購入を予定していたDANジャイレース活性測定キットの購入量が少なく済んだため。DNAジャイレースを阻害するキノロン系抗菌薬は、黄色ブドウ球菌ではDNAジャイレースに加えDNAトポイソメラーゼIVを阻害することが知られていることからDNAトポイソメラーゼIVの購入費として使用する。
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