2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K08786
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
阿部 章夫 北里大学, 感染制御科学府, 教授 (50184205)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | III型分泌装置 / ボルデテラ属細菌 / 百日咳菌 / 気管支敗血症菌 / エフェクター / BspR / 核移行シグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
百日咳菌ならびに気管支敗血症菌は，III型分泌装置を介してエフェクターとよばれる病原因子を宿主細胞内に注入する。これら病原菌のエフェクターは気道への長期定着に関与しているが，その機能については不明である。これまで申請者は，BspRと命名した因子がIII型分泌装置によって宿主細胞内に移行するとともに菌体内ではIII型分泌装置の発現を負に制御していることを明らかにしてきた。宿主内ならびに菌体内でのBspRの機能を精査することで，感染動態における役割を明らかにすることが本研究の目的である。
BspRの宿主移行能と病原性との関連をより詳細に解析するために，N末端側に赤色蛍光タンパク質mCherryを挿入することで宿主細胞内に移行できないBspR変異体を作製した。この変異株のフェノタイプについてBspR野生株と比較したところ，BspRが菌体内に局在することで，本来の負の制御因子としての効果が増強された。以上の結果，BspRが菌体外に分泌されるという現象は，III型分泌装置をコードする遺伝子発現のファインチューニングに関与していることが強く示唆された。
一方，BspRの核移行シグナルは，N末端の1-60アミノ酸残基に存在することを明らかにしてきた。BspRのN末端側について欠損変異を作製しBspRの宿主移行能を評価した結果，1-41アミノ酸残基の欠失でBspRの核移行が著しく低下した。BspRの菌体外分泌に必要なシグナル配列は1-54アミノ酸残基であることを既に明らかにしているが，菌体外分泌と核移行に必要なシグナルはともにN末端側に局在していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
BspRの核移行シグナルについてはN末端側に限局することができたので，概ね順調に進捗している。一方，BspRの宿主移行能と病原性の関連を精査するために，宿主移行能が欠失したBspRを作製した。しかし，BspRは菌体内において負の制御因子として機能しており，宿主移行能を欠くBspRは，III型分泌装置の発現を著しく抑制していた。このため，作製したBspR変異はBteA（貪食作用の阻害と細胞傷害の誘導に関与するエフェクター）の発現をも抑制することになり，細胞内移行に欠失をもつBspRについて，純粋に評価することができないという結論に至った。
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| Strategy for Future Research Activity |
BspRの宿主移行能と病原性との関連を解析するために，N末端側にmCherryを挿入することで宿主細胞内に移行できないBspR変異体を作製した。しかしこの変異体は，他のエフェクターの細胞内移行にも影響をおよぼすことが明らかとなった。一方，BspRの核移行シグナルはN末端側に局在していることが明らかとなり，今後，N末端側の欠失変異体，アミノ酸点変異等の挿入により，核移行シグナルについての更なる情報が得られると予想される。もし，BspRの菌体外分泌と核移行のシグナルが分離可能であれば，核移行シグナルのみを欠失した変異体の作製が可能となる。これにより，菌体外分泌はBspR野生株と同じ表現型を示すので，III型分泌装置の抑制効果を排除できると考えられる。BspR野生株は細胞の核内に移行する性質をもつので，核内での機能発現が予想される。核移行シグナルの欠失変異体とBspR野生株を用いて感染実験を行うことで，BspRの核内移行が病原性に関与するのかを調べることが可能である。
また，N末端にmCherryが挿入されたBspR変異体は，BspR野生株と比較して，III型分泌装置の抑制効果が強いものの，本来の負の制御因子としての機能は保持していた。mCherryは赤色蛍光タンパク質であるので菌体内でのBspRの動態を1分子蛍光イメージング法にて解析することが可能である。BspRはIII型分泌装置の発現を負に制御するとともに，III型分泌装置によって菌体外に分泌されることでフィードバック制御が働いていると予想される。可視化できるBspRを利用することでBspRの機能をさらに精査する予定である。
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