肝臓の血液浄化機能に着目した新たな敗血症治療法の確立～LL-37ペプチドを用いて

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08789
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 鈴木 香 順天堂大学, 医学部, 助教 (90631929)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 長岡 功 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60164399)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 抗菌ペプチド / 内毒素 / 血液浄化 / 血管内皮細胞 / オートファジー

Outline of Annual Research Achievements

グラム陰性菌の膜成分であるリポ多糖（LPS）は内毒素とも呼ばれ、敗血症の主要な病原因子である。一方、ヒトの好中球や上皮細胞から放出される生体防御ペプチドLL-37は、LPSと結合してこれを中和する。我々は、LPSと結合したLL-37が肝臓の類洞内皮細胞に速やかに取り込まれ、リソソームに移行することを報告している。このため、LL-37は血中に混入したLPSの除去剤として敗血症の治療に役立つ可能性がある。
昨年度の研究成果として、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）にLL-37を作用させた際にオートファジーが活性化されることを見いだした。これにより、LL-37とLPSはオートファジーによって消化される可能性が示された。
本年度は一つ目として、LL-37がオートファジーによって分解されるか調べた。まず、HUVEC培養系に添加したLL-37の挙動を調べたところ、LL-37は核周囲に局在し、さらに、一部はオートファゴソームマーカーLC3と共局在した。また、オートファジーの阻害剤やオートファジー必須遺伝子の発現抑制系を用いた結果、オートファジーを阻害した状況においてLL-37の分解が遅延した。
二つ目として、オートファジー機能不全のHUVECにおいて、LL-37が細胞の生存にどのような影響を示すか検討した。その結果、オートファジーを阻害した細胞ではLL-37の添加によって生細胞が減少し、アポトーシス細胞が増加した。
以上の結果、LL-37はヒト血管内皮細胞に作用してオートファジーを活性化し、自身の消化を促進することが明らかとなった。このことは、血中LPSの除去剤としてLL-37を用いた場合、LL-37はLPSと結合して類洞内皮細胞に取り込まれ、オートファジーによって分解される可能性を示す。一方、オートファジー機能不全に陥った血管内皮細胞に対して、LL-37は細胞死を誘導する可能性が示された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

LL-37とLPSの取り込みにオートファジーが関わることが示唆されたため、当初の研究計画を若干修正して、LL-37によるオートファジーのメカニズムやその意義の解明に注力した。このためオートファジー必須遺伝子atg7のin vitroノックダウン系を確立して、解析した結果、LL-37の細胞内消化にオートファジーが関わることを明らかにすることができた。しかしながら、これらの研究に必須である血管内皮細胞用培養培地が世界的な品薄状態に陥り入手困難となったため、研究に遅れが生じた。
このような理由により、LL-37の改変ペプチドを用いた機能解析などはやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

今年度の成果として、LL-37はヒト血管内皮細胞に作用してオートファジーを活性化し、自身の細胞内消化を促進することを明らかにした。一方、オートファジー機能不全に陥った血管内皮細胞に対して、LL-37は細胞死を誘導する可能性が示された。
今後は、LL-37によるオートファジー活性化のメカニズムについて、特にLL-37の細胞内局在に注目して明らかにする。さらに、オートファジー機能不全に陥った血管内皮細胞は何故、LL-37の暴露によって細胞死を起こすのかについても解明する。
また、敗血症モデルマウスにLL-37を投与し、LPSのクリアランスの促進効果を明らかにするとともに、その際、オートファジーの活性化が関わるかどうかを調べる。

Causes of Carryover

理由：オートファジーの関与を明らかにするin vitro系の研究に注力し、代わりに改変ペプチドを用いた機能ドメインの同定や動物を用いた実験を十分におこなうことができなかった。したがって、ペプチド合成や実験動物の購入費用が予定額に届かなかった。また、使用している血管内皮細胞培養培地が世界的に品薄状態となったため、培地の購入量が予定より減少した。
使用計画：敗血症モデルマウスを用いてLL-37ペプチドのLPS除去作用を明らかにするため、実験動物の購入をする必要がある。また、血管内皮細胞培養培地の生産も元に戻りつつあるとのことである。

Research Products

• [Journal Article] 肝類洞内皮細胞の血液浄化作用に対するヒト生体防御ペプチドLL-37の効果 －エンドトキシン除去作用に着目して－. (2018)
  • Author(s): 鈴木 香, 村上泰介, 胡 忠双, 長岡 功
  • Journal Title: 日本血管血流学会誌 Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
• [Journal Article] Protective effect of a newly developed fucose-deficient recombinant antithrombin against histone-induced endothelial damage. (2018)
  • Author(s): Iba T, Hirota T, Sato K, Nagaoka I
  • Journal Title: International Journal of Hematology Volume: 107 Pages: 528-534
  • DOI: 10.1007/s12185-018-2402-x
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Oncostatin M causes liver fibrosis by regulating cooperation between hepatic stellate cells and macrophages in mice. (2018)
  • Author(s): Matsuda M, Tsurusaki S, Miyata N, Saijou E, Okochi H, Miyajima A, Tanaka M
  • Journal Title: Hepatology Volume: 67 Pages: 296-312
  • DOI: 10.1002/hep.29421.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Evaluation of the effect of aloe-emodin on the proliferation and apoptosis of human synovial MH7A cells; a comparison with methotrexate. (2017)
  • Author(s): Hashiguchi M, Suzuki K, Kaneko K, Nagaoka I
  • Journal Title: Molecular Medicine Reports Volume: 15 Pages: 4398-4404
  • DOI: 10.3892/mmr.2017.6541.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Antimicrobial cathelicidin peptide LL-37 induces NET formation and suppresses the inflammatory responses in a mouse septic model. (2017)
  • Author(s): Hosoda H, Nakamura K, Hu Z, Tamura H, Reich J, Kuwahara-Arai K, Iba T, Tabe Y, Nagaoaka I
  • Journal Title: Molecular Medicine Reports Volume: 16 Pages: 5618-5626
  • DOI: 10.3892/mmr.2017.7267.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Neutrophil extracellular traps (NETs) induces the IL-1β production by macrophages in combination with lipopolysaccharide. (2017)
  • Author(s): Hu Z, Murakami T, Tamura H, Reich J, Kuwahara-Arai K, Iba T, Tabe Y, Nagaoka I
  • Journal Title: International Journal of Molecular Medicine Volume: 39 Pages: 549-558
  • DOI: 10.3892/ijmm.2017.2870.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Evaluation of the effect of recombinant thrombomodulin on a lipopolysaccharide-induced murine sepsis model. (2017)
  • Author(s): Takehara K, Murakami T, Kuwahara-Arai K, Iba T, Nagaoka I, Sakamoto K
  • Journal Title: Experimental and Therapeutic Medicine Volume: 13 Pages: 2969-2974
  • DOI: 10.3892/etm.2017.4308.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The comparison of the protective effects of α- and β-antithrombin against vascular endothelial cell damage induced by histone in vitro. (2017)
  • Author(s): Iba T, Sasaki T, Ohshima K, Sato K, Nagaoka I, Thachil J
  • Journal Title: TH Open Volume: 1 Pages: e3-e10
  • DOI: 10.1055/s-0037-1603926
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Depletion of myeloid cells exacerbates hepatitis and induces an aberrant increase in histone H3 in mouse serum. (2017)
  • Author(s): Piao X, Yamazaki S, Komazawa-Sakon S, Miyake S, Nakabayashi O, Kurosawa T, Mikami T, Tanaka M, Van Rooijen N, Ohmuraya M, Oikawa A, Kojima Y, Kakuta S, Uchiyama Y, Tanaka M, Nakano H.
  • Journal Title: Hepatology Volume: 65 Pages: 237-252
  • DOI: 10.1002/hep.28878.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Expression and localization of sterile alpha motif domain containing 5 is associated with cell type and malignancy of biliary tree. (2017)
  • Author(s): Yagai T, Matsui S, Harada K, Inagaki FF, Saijou E, Miura Y, Nakanuma Y, Miyajima A, Tanaka M
  • Journal Title: PLoS One Volume: 12 Pages: e0175355
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0175355
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] YAP determines the cell fate of injured mouse hepatocytes in vivo. (2017)
  • Author(s): Miyamura N, Hata S, Itoh T, Tanaka M, Nishio M, Itoh M, Ogawa Y, Terai S, Sakaida I, Suzuki A, Miyajima A, Nishina H
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 8 Pages: 16017
  • DOI: 10.1038/ncomms16017.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] ヒト抗菌ペプチド LL-37 による血管内皮細胞のオートファジー誘導. (2018)
  • Author(s): 鈴木 香，大熊真理，長岡 功
  • Organizer: 第91回日本細菌学会総会（福岡）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Analysis of the components of neutrophil-derived microparticles with antibacterial activity. (2018)
  • Author(s): Li Yan，熊谷由美，鈴木 香，長岡 功
  • Organizer: 第91回日本細菌学会総会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Involvement of MrgX2-mediated LL-37 internalization in degranulation of human mast cells. (2018)
  • Author(s): 村上泰介，鈴木 香，長岡 功
  • Organizer: 第91回日本細菌学会総会（福岡）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Antimicrobial peptide LL-37 induces microparticle release from neutrophils in a mouse sepsis model. (2018)
  • Author(s): 熊谷由美，Li Yan，村上泰介，田村弘志，長岡 功
  • Organizer: 第91回日本細菌学会総会（福岡）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ヒト抗菌ペプチドLL-37は血管内皮細胞のオートファジーを活性化する. (2017)
  • Author(s): 鈴木 香, 長岡 功
  • Organizer: 第4回日本血管血流学会学術集会 （福岡）
• [Presentation] ヒト抗菌ペプチドLL-37 による肝類洞内皮細胞のLPS 取り込み促進作用. (2017)
  • Author(s): 鈴木 香, 長岡 功
  • Organizer: 第100回日本細菌学会関東支部会総会（東京）
• [Presentation] Involvement of MrgX2 in the internalization of LL-37 and degranulation of LAD2 human mast cells. (2017)
  • Author(s): Murakami T, Suzuki K, Nagaoka I
  • Organizer: Society for Leukocyte Biology 50th Annual Meeting (Vancouver, Canada)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ヒト抗菌ペプチドLL-37は血管内皮細胞にオートファジーを誘導する. (2017)
  • Author(s): 鈴木 香, 長岡 功
  • Organizer: 第64回トキシンシンポジウム（兵庫）
• [Presentation] NETs形成に注目した、抗菌ペプチドLL-37の敗血症マウスモデルに対する効果の検討. (2017)
  • Author(s): 長岡 功, 細田浩司, 中村果歩, 胡 忠双, 村上泰介, 鈴木 香, 田村弘志
  • Organizer: 第23回日本エンドトキシン・自然免疫研究会（兵庫）
• [Presentation] 抗菌ペプチドLL-37はNET形成を誘導して敗血症マウスモデルの生存率を改善する. (2017)
  • Author(s): 細田浩司, 中村果歩, 胡 忠双, 田村弘志, 長岡 功
  • Organizer: 第64回トキシンシンポジウム（兵庫）
  • Invited
• [Presentation] Antimicrobial cathelicidin peptide LL-37 protects septic mice by modulating macrophage pyroptosis and neutrophil NETosis. (2017)
  • Author(s): Nagaoka I, Hosoda H, Hu Z, Nakamura K, Murakami T, Tamura H, Reich J
  • Organizer: Society for Leukocyte Biology 50th Annual Meeting (Vancouver, Canada)
  • Int'l Joint Research
• [Book] エンドトキシン・自然免疫研究20（隅田泰生、長岡 功 編集）「平成 28 年度日本エンドトキシン・自然免疫研究会奨励賞・最優秀賞受賞講演：ヒト生体防御ペプチドLL-37の血管内皮細胞に対する作用 ～エンドトキシンとの相互作用について～」 (2017)
  • Author(s): 深瀬 浩一, 下山 敦史, 藤本ゆかり, 鈴木香, 長岡功, 土谷正和, 清水智治, 小幡徹, 園田寛道, 三宅亨, 遠藤善裕, 谷徹, 谷眞至, 高橋徹, 萩沢康介, 木下学, 宮脇博基, 佐藤俊一, 鈴木英紀, 武岡真司 他
  • Total Pages: 67 (7-13)
  • Publisher: 医学図書出版株式会社
• [Book] 抗菌ペプチドの機能解明と技術利用（長岡 功 監修）「Cathelicidin抗菌ペプチドの作用メカニズムと敗血症治療への応用」 (2017)
  • Author(s): 鈴木香, 長岡功, 川村出, 岩室祥一, 若林裕之, 橋本茂樹, 田口精一, 山﨑浩司, 吉村幸則, 相沢智康, 谷口正之, 落合秋人, 加治屋勝子, 南雄二, 中神啓徳, 田村弘志, Johannes Reich, 伊藤英晃, ニヨンサバ フランソワ, 善藤威史 他
  • Total Pages: 239 (151-162)
  • Publisher: シーエムシー出版
  • ISBN: 978-4-7813-1245-3
• [Book] 抗菌ペプチドの機能解明と技術利用（長岡 功 監修）「はじめにー太古の昔から存在する生体防御分子を用いた応用技術」 (2017)
  • Author(s): 長岡功, 鈴木香, 川村出, 岩室祥一, 若林裕之, 橋本茂樹, 田口精一, 山﨑浩司, 吉村幸則, 相沢智康, 谷口正之, 落合秋人, 加治屋勝子, 南雄二, 中神啓徳, 田村弘志, Johannes Reich, 伊藤英晃, ニヨンサバ フランソワ, 善藤威史 他
  • Total Pages: 239 (巻頭)
  • Publisher: シーエムシー出版
  • ISBN: 978-4-7813-1245-3
• [Book] 抗菌ペプチドの機能解明と技術利用（長岡 功 監修）「エンドトキシン測定法と抗菌ペプチド」 (2017)
  • Author(s): 田村弘志, Johannes Reich, 長岡功, 鈴木香, 川村出, 岩室祥一, 若林裕之, 橋本茂樹, 田口精一, 山﨑浩司, 吉村幸則, 相沢智康, 谷口正之, 落合秋人, 加治屋勝子, 南雄二, 中神啓徳, 伊藤英晃, ニヨンサバ フランソワ, 善藤威史 他
  • Total Pages: 239 (134-147)
  • Publisher: シーエムシー出版
  • ISBN: 978-4-7813-1245-3
• [Remarks] 順天堂大学 大学院医学研究科 生化学・生態防御学（生化学第二）
  • URL: http://www.juntendo.ac.jp/graduate/laboratory/labo/seikagaku_seitaibogyo/html/index_j.html