2017 Fiscal Year Research-status Report

レプトスピラの維持宿主動物における持続感染機構の分子基盤の解明

Research Project

Project/Area Number	16K08797
Research Institution	National Institute of Infectious Diseases
Principal Investigator	小泉信夫国立感染症研究所, 細菌第一部, 主任研究官 (10333361)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	レプトスピラ / 維持宿主 / 持続感染
Outline of Annual Research Achievements	人獣共通感染症であるレプトスピラ症の病原体レプトスピラは，維持宿主動物と呼ばれる哺乳動物の腎臓に持続感染することができるが，持続感染に必須のレプトスピラ因子はほとんど明らかになっていない．本研究は，トランスポゾン挿入変異法によりゲノムワイドなレプトスピラランダム変異体ライブラリーを作製して維持宿主動物の感染実験を行い，腎臓に定着できない変異体を同定することにより，レプトスピラの維持宿主における持続感染機構の分子基盤を総合的に解明することを目的とする．レプトスピラ血清型Manilae株のラットWKAH/Hkmでの腎臓定着率が安定しなかったため，他系統のラットWisterおよびマウスC57BL/6Jで感染実験を行った．その結果，Wisterにおける腎臓定着率はWKAH/Hkmと変わらず，C75BL/6Jには致死的な感染を引き起こすことが明らかとなった．そこでWKAH/Hkmメス4週齢に1匹当たりトランスポゾン挿入株96株を各約10の6乗細胞（計約10の8乗細胞）腹腔内接種し，21日後に腎臓を回収し培養を行った．接種前培養（インプット）および腎臓培養（アウトプット）からDNA抽出を行い，Nextera XTキット（イルミナ）を用いてトランスポゾン挿入近傍のDNAライブラリーを作製した．MiSeqによりライブラリーのDNAシーケンスを行った結果，インプットで検出されるがアウトプットでは検出できないDNA断片を複数同定することができた．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason Manilae株の持続感染モデル動物を選定すること，Nextera XTキットでのライブラリー作製の条件検討に時間がかかってしまった．
Strategy for Future Research Activity	腎臓に定着できなかった変異株をライブラリーから回収し，単独で感染実験を行い腎臓定着性を再確認するとともに，①培養細胞monolayer通過性，②血清耐性（補体耐性），③腎上皮培養細胞への接着能のどのステップに欠損があるかを明らかにする．
Causes of Carryover	持続感染モデル動物の選定に時間がかかってしまい，スクリーニング規模が想定より小さくなってしまったため．また一部は年度末納品等にかかる支払いが平成30年4月1日以降となったため，当該支出分については次年度の実支出額に計上予定．