2018 Fiscal Year Research-status Report
ニパウイルスN蛋白の核移行によるIFNシグナル伝達阻害および細胞応答の解明
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16K08805
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
佐藤 宏樹 東京大学, 医科学研究所, 特任講師 (50418654)
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2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ウイルス / ニパウイルス / N蛋白 / 核移行 / インターフェロン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マイナス鎖一本鎖RNAをゲノムに持つパラミクソウイルス科のウイルスは、複製の過程を全て細胞質で行うが、その中でモービリウイルス属とヘニパウイルス属のnucleo-（N）蛋白は核と細胞質の両方に局在する特徴的な性質をもつ。
これまで、パラミクソウイルスのphospho-（P）遺伝子から産生される複数の蛋白が宿主細胞のインターフェロン (IFN) シグナル伝達を阻害することが報告されてきたが、申請者らはモービリウイルスのN蛋白も強いIFN阻害活性を持ち、その活性発現にN蛋白の核移行が重要であることを明らかにした。
本研究では、モービリウイルス同様に核移行能を有するヘニパウイルスN蛋白のIFNアンタゴニスト活性を明らかにし、さらに核内外に輸送されるメカニズムおよび核内におけるN蛋白の相互作用因子を検索し、これまで未知であるN蛋白の核移行の意義について解明することを目的とする。
平成２９年度は、ヘニパウイルスN蛋白がIFNシグナル伝達経路の中でSTAT1, 2分子の高分子複合体の形成を阻害しシグナル伝達を抑制するという新たな機構を明らかにした。そこで平成３０年度は、ヘニパウイルスN蛋白のもつ核移行能がIFN阻害活性にどのように関与するか検索するために、N蛋白内の核移行シグナル配列と核外輸送シグナル配列の同定を試みた。これまでにモービリウイルスN蛋白において、欠失変異体とアラニンスキャニング法を用いて両シグナル配列の同定を行った実績があるため、同手法をヘニパウイルスN蛋白にも適用した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成３０年度は、ヘニパウイルス属のニパウイルスN蛋白について、核移行シグナルおよび核外輸送シグナルの同定を試みた。以前モービリウイルスN蛋白でシグナル配列を同定した時と同様に、一連の欠失変異体を作製し、細胞内局在を蛍光抗体法で観察した。その結果、モービリウイルスと同じく複数の領域の欠失により核移行の消失が見られた。
そこで続いて当該領域を４アミノ酸ずつアラニン残基に置換したアラニンスキャニング法で、広範囲を網羅する一連の変異体を作製し、局在を観察した。
ところがモービリウイルスと異なり、明確に核移行能の消失する変異体が得られず、従来の方法ではシグナル配列の同定が不可能であることが判明した。この結果を受け、補助事業期間延長承認の申請を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の結果からN蛋白の高次構造が核移行の輸送メカニズムに重要であると推察され、特に他の蛋白と相互作用し複合体として間接的に運ばれる可能性が考えられる。そこで、pulldownアッセイによる相互作用検出を行い、細胞の核内輸送蛋白であるimportinファミリーのうちどの分子によって輸送されるのか明らかにする。N蛋白上の重要な高次構造が同定されたら、当該箇所に変異をもつ変異ウイルスの作出を試みる。ニパウイルスは日本国内で使用できないため、同様にN蛋白が核移行能を持つ近縁の麻疹ウイルスでまず作出を行い、最終的にマウス動物実験モデル系での病態表現系の解析を行う。
興味深い知見が得られた際は、共同研究先のフランス・リヨンのINSERM研究所で組換えニパウイルスの作出と性状解析を行う。
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| Causes of Carryover |
2017年度までにニパウイルスN蛋白の核移行の意義を明らかにすることができたため、2018年度はN蛋白アミノ酸配列上の核移行シグナルと核外輸送シグナルを同定し輸送メカニズムを明らかにする予定であった。しかし、通常の同定手法を用いてもシグナル配列を決定することができず、これまでにない実験手法の試行錯誤等のために研究遂行に遅延が生じた。次年度使用額は主に新たな実験系のための物品費として使用予定である。
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