2016 Fiscal Year Research-status Report
高速原子間力顕微鏡を用いたウイルス転写複合体の微細構造解析
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16K08808
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
中野 雅博 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (90456997)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | インフルエンザウイルス / 転写 / 複製 / 高速原子間力顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
インフルエンザウイルスのゲノムRNAは、核タンパク質NPやポリメラーゼとともにvRNPを形成する。ウイルス粒子から精製したvRNPは二重らせん構造を持つことが明らかとなっているが、mRNAあるいはcRNA合成中のvRNPの構造については全く解明されておらず、また、これらのRNAがどのようにして合成されるのかも分かっていない。そこで本研究では、高速原子間力顕微鏡（AFM）を用いて機能的な状態のvRNPを解析することによって、微細構造学的観点からインフルエンザウイルスのゲノム転写・複製機構を明らかにすることを目的とした。
初めに、ウイルスより精製したvRNPを用いてin vitro RNA合成反応を行い、qRT-PCRによりmRNAおよびcRNAが合成されることを確認した。続いて、in vitro RNA合成中のvRNP複合体を高速AFMで観察した結果、①二重らせん構造を維持したvRNPが二次構造を形成したRNAと結合している様子が認められた。さらに、②二重らせん構造が崩れたvRNPが二次構造を取っていないループ状RNAと結合している様子も観察された。まず、二次構造を形成したRNAについては、核酸アナログを用いた実験からvRNPにより合成されたRNAであることを確認した。一方で、二次構造を取らないループ状のRNAも同様にvRNPにより合成されたRNAであることを確認したが、興味深いことに、二本鎖RNAであることが明らかとなった。今回の結果から、vRNPによるRNA合成には上記①と②の２パターンが存在することが分かったが、これらがmRNA合成とcRNA合成の違いを表しているのかどうかを明らかにすることが今後の課題である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
インフルエンザウイルスvRNPによるループ状RNAの形成に関しては、vRNPにより新規に合成されたRNAであることを確認したことに加え、二本鎖RNAであることを新たに明らかにした。またループ状RNAとは別に、二次構造を形成したRNAが合成されることも明らかとなった。これらの成果はインフルエンザウイルスゲノムの転写・複製機構を考えるうえで新たな知見となり、それにより当初の想定以上に学術的に意義のある結果が得られたと考えている。一方で、ライブイメージングのための基板の検討については時間を割くことができなかったため、全体としてはおおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
インフルエンザウイルスvRNPによって合成されるループ状RNAと二次構造を形成するRNAについて、それぞれが示す意味について明らかにする。すなわち、どちらがmRNA（転写）、cRNA（複製の第一段階）を示したものなのかを明らかにするために、qPCRなどを組み合わせた方法により研究を推進していく。また、ライブイメージングについても同時に研究を進めていき、脂質膜上でのRNA合成反応が可能な条件を決定し、リアルタイムでvRNPがRNAを合成する様子を観察していきたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
当初の想定よりも研究が順調に進み、経費の削減を行うことができたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ライブイメージングに必要なカンチレバーや脂質等の購入に使用する。
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